牡丹花蕊黃酮對H2O2誘導RAW264.7巨噬細胞損傷的保護作用

羅 磊，關寧寧，楊永慶，張冰潔，馬麗蘋，朱文學,*

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2.洛陽牡丹生物科技研究院，河南 洛陽 471023）

眾所周知，自由基與各種細胞信號轉導之間存在密切的聯系。體內代謝和外源性的自由基可通過細胞轉導的途徑調控細胞的狀態，甚至介導疾病的發生與發展[1]。自由基具有很強的氧化作用，能夠導致細胞內脂質、核酸和氨基酸的過氧化損傷，破壞細胞結構并引起細胞功能紊亂，從而致使細胞衰老、癌變甚至死亡[2-4]。細胞內的活性氧（reactive oxidative species，ROS）作為新陳代謝的產物在各類細胞中不斷產生和清除，其種類包括O2－?、H2O2及HO2?、?OH等。一定濃度的ROS通過細胞氧化應激反應能夠誘導細胞凋亡甚至導致其壞死，因此H2O2與細胞衰老、凋亡有著密切的聯系。抗氧化體系是機體用來減緩和預防氧化的第一道防線，包括抗氧化酶類和非酶類物質，體內的大多數過氧化物都能夠被此體系捕捉并清除。其中酶促系統主要包括過氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等，是細胞內清除ROS的主要酶[5]；非酶類主要是一些低分子物質，例如VC、VE[6]及谷胱甘肽（glutathione，GSH）等[7-8]。丙二醛（malondialdehyde，MDA）以及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素[9-10]。黃酮在自然界的植物和漿果中廣泛存在，它的功效是多方面的，包括較好的抗氧化性、改善心腦血管疾病、抗炎、抗癌和抗衰老等[11]。

牡丹屬于毛莨科芍藥屬植物，具有“國色天香”之稱。其根皮可以入藥，其中含有牡丹酚和植物甾醇等生物活性成分[12]。花瓣中的抗氧化物質（總酚和類黃酮）的含量也很高，其水提液能夠清除多種自由基[13]。牡丹籽則可以作為一種油料資源，其中含有多種藥理成分，具有很高的營養價值[14]。但是關于牡丹花蕊的研究卻較少。隨著牡丹的綜合利用及開發越來越多，近年來對牡丹花蕊中黃酮類化合物的研究也有了初步的進展。傅茂潤等[15]的研究顯示牡丹花蕊能夠清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，具有很強的抗氧化性。李朝蘋等[16]的研究表明牡丹花蕊的水提液中含有生物活性物質黃酮和總酚酸，其在體內外的抗氧化功效中發揮重要作用。目前大部分研究還集中于牡丹花蕊黃酮的提取、鑒定以及初步的體外抗氧化階段，而關于牡丹花蕊黃酮對細胞及機體影響的研究很少。本實驗通過創建RAW264.7巨噬細胞損傷模型，測定細胞和細胞培養液中各種抗氧化酶類（CAT和SOD等）以及小分子非酶物質（GSH）的水平，來研究牡丹花蕊黃酮對H2O2誘導的細胞損傷的抗氧化和抗炎能力，為開發牡丹花蕊黃酮的功能性食品及藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡丹花蕊于2016年5月在洛陽牡丹園采得。

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 南京科佰生物科技有限公司；RPMI-1640培養基 美國Hyclone公司；噻唑藍（methyl thiazoly1 tetrazolium，MTT） 美國Sigma公司；雙抗（青霉素-鏈霉素）、胎牛血清、胰酶 美國Gibco公司；SOD、CAT、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、GSH-Px、GSH、MDA以及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；CKX41倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；E191IR型CO2細胞培養箱 美國金西盟公司；680全自動酶標儀 美國Bio-Rad公司；微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠有限公司；HL-2D型恒流泵 上海圣科儀器設備有限公司；UV2400紫外-可見分光光度計上海舜宇恒平科學儀器有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牡丹花蕊黃酮的提取

稱取過篩的牡丹花蕊粉末50 g，用體積分數為60%的乙醇溶液按料液比1∶30的比例混合，在提取溫度60 ℃、功率300 W的條件下超聲提取40 min，抽濾，50 ℃下減壓濃縮至無乙醇味，真空冷凍干燥成粉備用。

1.3.2 牡丹花蕊黃酮的純化

預處理D-101樹脂，將1.3.1節中所得的牡丹花蕊黃酮粉末配制成質量濃度為2.0 mg/mL的上樣液，以1.50 mL/min的上樣流速對樹脂進行純化，先用3.0 BV蒸餾水以1.5 mL/min的流速洗脫除雜，再用體積分數為95%的乙醇溶液以3.0 mL/min的流速洗脫，收集乙醇洗脫液，旋轉蒸發，真空冷凍干燥后置于4 ℃冰箱中保存，備用。采用分光光度法測定其含量，牡丹花蕊黃酮的質量分數大于70%。

1.3.3 RAW264.7巨噬細胞培養

先配制含質量分數1%雙抗和質量分數10%的胎牛血清RPMI-1640培養基，再將細胞接種于裝有適量培養基的細胞培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養[17]。細胞培養瓶中的細胞覆蓋率達到70%～80%時進行傳代，根據細胞的生長速率定時更換培養液。

1.3.4 RAW264.7巨噬細胞氧化損傷模型的建立

取對數生長期的RAW264.7巨噬細胞，按每孔200 μL的量接種于96 孔板中，調整細胞密度為2.0×105個/mL。在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，當細胞達到貼壁狀態時，棄去上清液，加入由RPMI-1640培養基配制成的不同濃度梯度的H2O2溶液，每個梯度6 個平行。再培養24 h后，棄去上清液，用緩沖液洗滌2 次后，每孔分別加入200 μL的培養基及10 μL質量濃度為5 mg/mL的MTT，放入CO2培養箱中培養4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫放置10 min，放入酶標儀于490 nm波長處測定吸光度，根據公式（1）計算細胞存活率。

式中：A0為空白組的平均吸光度；A1為不同濃度H2O2組的平均吸光度。

1.3.5 牡丹花蕊黃酮質量濃度的篩選

細胞培養過程同1.3.4節，僅將1.3.4節中所加入的RPMI-1640培養基配制的H2O2溶液換成同種培養基配制的不同質量濃度的牡丹花蕊黃酮溶液，并通過公式（1）計算細胞存活率。

1.3.6 細胞及細胞培養液中SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px、GSH、MDA以及LDH水平的測定

將細胞密度為2.0×105個/mL的RAW264.7巨噬細胞接種于6 孔板中，每孔2.0 mL，放在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。24 h后，細胞完全貼壁，吸棄細胞培養液，空白組和H2O2損傷組加入2.0 mL培養基；牡丹花蕊劑量組分別加入2.0 mL不同質量濃度的牡丹花蕊黃酮培養液；VC對照組加入2.0 mL質量濃度為250 μg/mL的VC培養液，置于培養箱中培養。24 h后，吸棄上清液，每孔加入800 μmol/L H2O2溶液2.0 mL，置于培養箱中培養4 h后將細胞和細胞培養液分離。細胞培養液離心（4 ℃、1 500 r/min、5 min）后取上清液待測；細胞用磷酸鹽緩沖液清洗2 次后，采用吹打的方式收集細胞，離心（4 ℃、1 000 r/min、10 min）保留細胞團塊，加入0.5 mL磷酸鹽緩沖液，冰水浴條件下超聲破碎（400 W，3～5 s/次，間隔30 s，重復3 次），待測。參照相應試劑盒方法測定細胞及細胞培養液中SOD、CAT、T-AOC、GSH-Px、GSH、MDA以及LDH水平。

1.4 數據處理

利用DPS 7.5軟件進行統計分析，測定數據以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析并用LSD法進行多重比較， P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 H2O2濃度的篩選

由圖1可知，各梯度的H2O2溶液對RAW264.7巨噬細胞的生長均有一定抑制作用，且細胞存活率隨H2O2濃度的升高呈下降趨勢。與空白組相比，不同濃度的H2O2抑制RAW264.7巨噬細胞生長的效果十分明顯，當H2O2濃度為800 μmol/L時，RAW264.7巨噬細胞存活率為51.88%，則以此濃度作為RAW264.7巨噬細胞的半致死濃度。H2O2濃度過低時，不能有效抑制細胞的增殖，而H2O2濃度過高則會引起細胞死亡過量，因此建立細胞模型時，采用H2O2的濃度為800 μmol/L。

圖1 不同濃度H2O2對RAW264.7巨噬細胞增殖作用的影響Fig.1 Dose-dependent effects of hydrogen peroxide on the viability of RAW264.7 cells

2.2 牡丹花蕊黃酮質量濃度的篩選

圖2 不同質量濃度牡丹花蕊黃酮對RAW264.7巨噬細胞增殖作用的影響Fig.2 Dose-dependent effects of flavonoids from peony stamens on the viability of RAW264.7 cells

圖2 表明，相較空白組，質量濃度在0～30 μg/mL范圍內的牡丹花蕊黃酮均可以促進RAW264.7巨噬細胞的生長。當牡丹花蕊黃酮質量濃度低于10 μg/mL時，對RAW264.7巨噬細胞的促生長作用不明顯；當其質量濃度為10、20、30 μg/mL時，促增殖作用顯著（P＜0.05）。當牡丹花蕊黃酮質量濃度大于30 μg/mL時，顯著抑制增殖（P＜0.05），因此，選擇后續實驗的牡丹花蕊黃酮質量濃度為10、20、30 μg/mL。

2.3 RAW264.7巨噬細胞及細胞培養液的T-AOC

抗氧化物質的作用主要是維持內環境ROS的動態平衡，清除過多的ROS，使機體處于相對穩定的狀態[18]。

圖3 RAW264.7巨噬細胞（A）及細胞培養液（B）的T-AOCFig.3 T-AOC activities in cultured RAW264.7 cells (A) and culture medium (B)

如圖3所示，與空白組相比，H2O2損傷組的細胞及其培養液的T-AOC均明顯降低（P＜0.05）；同時與H2O2損傷組相比，牡丹花蕊黃酮提高細胞及細胞培養液的T-AOC（P＜0.05），且呈劑量依賴性。牡丹花蕊黃酮高劑量組在細胞及細胞培養液的T-AOC與VC對照組相比無顯著差異（P＞0.05），低、中劑量組在細胞及細胞培養液的T-AOC均低于VC對照組，且差異顯著（P＜0.05）。

2.4 RAW264.7巨噬細胞及細胞培養液中SOD活力

SOD是一種重要的抗氧化劑，存在于各種生物細胞中，它能夠將超氧化物轉化為H2O2，H2O2再被CAT和過氧化物酶轉化為無害的水，從而達到清除胞內自由基和保護細胞的作用[19]。

圖4 RAW264.7巨噬細胞（A）及細胞培養液（B）中SOD活力Fig.4 SOD activities in cultured RAW264.7 cells (A) and culture medium (B)

如圖4所示，與空白組相比，H2O2損傷組細胞及細胞培養液中的SOD活力顯著降低（P＜0.05）；與H2O2損傷組相比，牡丹花蕊黃酮能有效提高細胞中SOD活力，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。除牡丹花蕊黃酮高劑量組在細胞中的SOD活力接近VC對照組外（P＞0.05），其他劑量組在細胞及細胞培養液中的SOD活力均低于VC對照組，差異顯著（P＜0.05）。

2.5 RAW264.7巨噬細胞及細胞培養液中GSH含量

GSH是一種低分子清除劑，它可清除超氧自由基和H2O2，能夠穩定含硫基的酶和抑制血紅蛋白及其他輔因子的氧化損傷[20]。

圖5 RAW264.7巨噬細胞（A）及細胞培養液（B）中GSH水平Fig.5 GSH contents in cultured RAW264.7 cells (A) and culture medium (B)

如圖5所示，與空白組相比，H2O2損傷組細胞和細胞培養液中的GSH水平顯著降低（P＜0.05）；而與H2O2損傷組相比，牡丹花蕊黃酮各劑量組抑制了細胞及細胞培養液中GSH水平的下降。除牡丹花蕊黃酮高劑量組在細胞及細胞液中的GSH水平接近VC對照組外（P＞0.05），其他劑量組在細胞及細胞培養液中的GSH水平均顯著低于VC對照組（P＜0.05）。VC對照組與空白組無顯著差異（P＞0.05）。

2.6 RAW264.7巨噬細胞及細胞培養液中GSH-Px活力

GSH-Px是一種過氧化物分解酶，它可以促進H2O2與GSH反應生成水及氧化型GSH，可以起到維持細胞膜結構和功能完整的作用[21]。

圖6 RAW264.7巨噬細胞（A）及細胞培養液（B）的GSH-Px活力Fig.6 GSH-Px activities in cultured RAW264.7 cells (A) and culture medium (B)

如圖6所示，與空白組相比，H2O2損傷組細胞和細胞培養液中的GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），與H2O2損傷組相比，牡丹花蕊黃酮各劑量組顯著提高細胞及細胞培養液中GSH-Px活力（P＜0.05）。牡丹花蕊黃酮低、中、高劑量組之間存在明顯的劑量依懶性（P＜0.05）。VC對照組在細胞及細胞培養液中的GSH-Px活力顯著高于牡丹花蕊黃酮各劑量組，且具有顯著差異（P＜0.05）。

2.7 RAW264.7巨噬細胞及細胞培養液的MDA水平

細胞內的ROS能使生物膜中的多不飽和脂肪酸發生脂質化反應。一部分的脂質過氧化物能引起細胞代謝及功能障礙，甚至死亡。MDA水平能體現機體內脂過氧化物的水平，從而反映細胞損傷的程度[22]。

圖7 RAW264.7巨噬細胞（A）及細胞培養液（B）中MDA水平Fig.7 MDA contents in cultured RAW264.7 cells (A) and culture medium (B)

如圖7所示，與空白組相比，H2O2損傷組細胞和細胞培養液中的MDA水平均顯著升高（P＜0.05）。與H2O2損傷組相比，牡丹花蕊黃酮低、中、高劑量組均顯著抑制了H2O2引起的細胞和細胞培養液中MDA水平的增加，并呈劑量依賴性。牡丹花蕊黃酮高劑量組MDA水平顯著低于VC對照組（P＜0.05）。

2.8 RAW264.7巨噬細胞及細胞培養液中CAT活力

圖8 RAW264.7巨噬細胞（A）及細胞培養液（B）的CAT活力Fig.8 CAT activities in cultured RAW264.7 cells (A) and culture medium (B)

CAT是機體抗氧化體系的關鍵酶之一，能夠將H2O2轉化成氧和水，從而減輕細胞損傷[23]。如圖8所示，與空白組相比，H2O2損傷組細胞和細胞培養液中的CAT活力顯著降低（P＜0.05），與H2O2損傷組相比，牡丹花蕊黃酮低、中、高劑量組顯著提高了細胞及細胞培養液中CAT活力，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。VC對照組的細胞及細胞液中的CAT活力顯著高于牡丹花蕊黃酮的各劑量組（P＜0.05）。

2.9 RAW264.7巨噬細胞及細胞培養液中LDH活力

圖9 RAW264.7巨噬細胞（A）及細胞培養液（B）中LDH活力Fig.9 LDH activities in cultured RAW264.7 cells (A) and culture medium (B)

LDH能夠催化丙酮酸生成乳酸，幾乎存在于所有組織中。當細胞受損時LDH將大量向細胞外釋放，導致其細胞外LDH的水平顯著升高，因此LDH活力可以反映細胞受氧化損傷程度[24]。如圖9所示，細胞中，H2O2損傷組的LDH活力顯著低于空白組（P＜0.05），而細胞培養液中的LDH活力顯著升高（P＜0.05），表明H2O2使細胞膜受損導致LDH向外擴散。與H2O2損傷組相比，牡丹花蕊黃酮各劑量組顯著提高了細胞中LDH活力，且降低了細胞培養液中LDH活力（P＜0.05），并呈劑量依賴性，表明牡丹花蕊黃酮可以預防或減緩細胞膜受損程度，阻止細胞內LDH向細胞外擴散。在細胞中，牡丹花蕊黃酮高劑量組的LDH活力接近VC對照組，無顯著差異（P＞0.05）。在細胞液中，牡丹花蕊黃酮高劑量組的LDH活力顯著低于VC對照組（P＜0.05）。

3 討 論

本實驗通過H2O2誘導RAW264.7巨噬細胞損傷來建立氧化應激損傷模型，以此探究牡丹花蕊黃酮的抗氧化活性。研究結果表明，H2O2濃度為800 μmol/L時，能夠對RAW264.7巨噬細胞造成有效的損傷，且細胞存活率在50%左右。牡丹花蕊黃酮具有促進RAW264.7巨噬細胞增殖的作用，其中質量濃度在10～30 μg/mL范圍內時，促增殖效果顯著。巨噬細胞作為機體免疫的重要參與者，可通過分泌細胞因子和抗原提呈作用等影響免疫炎癥反應的進程[25-28]。通過實驗可看出牡丹花蕊黃酮能夠顯著促進RAW264.7巨噬細胞的繁殖，可以側面反映出牡丹花蕊黃酮具有一定的抗炎效果。

本實驗通過測定細胞和細胞培養液中各種抗氧化酶類（CAT和SOD等）以及小分子非酶類物質（GSH）的水平來反映牡丹花蕊黃酮對H2O2誘導損傷的RAW264.7巨噬細胞的保護程度。實驗表明H2O2誘導損傷RAW264.7巨噬細胞后，細胞與細胞培養液中的有害物質MDA水平顯著升高，T-AOC以及各種抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT和LDH）活力顯著降低，表明H2O2能夠損害RAW264.7巨噬細胞的抗氧化機能，破壞細胞膜結構，導致細胞內各種抗氧化酶活力下降。而用不同劑量牡丹花蕊黃酮與H2O2聯合作用于RAW264.7巨噬細胞時，各劑量組抗氧化指標與H2O2損傷組相比，抗氧化能力顯著增強，且存在一定程度上的劑量-效應關系。牡丹花蕊黃酮不僅能夠提高細胞和細胞培養液中各種抗氧化指標的活性，清除有毒有害物質和自由基[25]，降低機體ROS的含量；而且還可以降低MDA水平，抑制脂質過氧化物的產生，減緩細胞損傷，增強機體的抗氧化能力[26-27]，維持細胞膜的完整與細胞的穩定，減輕LDH向細胞外擴散。VC具有極強的抗氧化性，在MDA、GSH水平和T-AOC、SOD活力的測定中，牡丹花蕊黃酮高劑量組和VC對照組的水平沒有顯著差異，則說明牡丹花蕊黃酮在一定質量濃度下是可以達到VC的抗氧化水平的。

綜上所述，牡丹花蕊黃酮可以顯著減緩RAW264.7巨噬細胞因H2O2誘導的抗氧化活性下降，并呈劑量-效應關系，還能夠增強細胞內抗氧化酶活力，降低機體內氧活性及有害物質的含量，維持細胞的穩定性。