綠變大蒜的色素成分及抗肝癌活性

劉 瑋，王京雅，陳海霞*

（天津大學藥物科學與技術學院，天津 300072）

百合科蔥屬植物（Allium sativum L.）大蒜作為一種香料和藥用植物被廣泛使用已經有4 000 年的歷史，其被加工成各種各樣的蒜類產品，比如大蒜粉、大蒜油、大蒜果汁、黑蒜和臘八蒜等，形態味道各異[1-6]。大蒜具有抗氧化、抗菌、抗癌活性及心血管保護作用等[7-9]。1956年，Joslyn等[10]發現將大蒜打成破碎的蒜泥后，加入乙酸能使其變綠。在我國北方，臘八蒜及發綠的醋浸大蒜就是一種綠變大蒜，它作為一種傳統的風味小食，深受人們喜愛[11-12]。根據洋蔥紅變機理[13]，推測大蒜綠變過程也經歷了類似的反應。當大蒜組織破碎，細胞液泡中的蒜氨酸酶與基質中的蒜氨酸以及其他含硫化合物發生一系列酶促反應和非酶反應，最終形成兩種色素，即黃色素（yellow pigments，YP）和藍色素（blue pigments，BP），它們分別在440 nm和590 nm波長處有最大吸收峰，而BP由于其不穩定性，會部分分解成YP，兩者混合形成綠色素[14-15]。大蒜綠變形成的色素完全溶解于體積分數70%～80%的丙酮溶液、微溶于正己烷和石油醚，且綠變大蒜丙酮提取的色素在400～450 nm波長處有強吸收[16]。趙曉丹[17]通過實驗證明醋漬綠變大蒜的色素分子Molish反應的結果均為陽性，這說明分子中可能有糖類的存在，同時色素可以被酸性水溶液較好地浸提出來，結合氫譜推測其結構中含有－NH2基團。陳聰[18]通過分離色素推測其相對分子質量為527，分子結構中含有C＝C、C＝S，可能為含N的吡咯衍生物。大蒜中的水溶性和脂溶性含硫化合物都具有較好的抗癌活性，比如二烯丙基硫化物能抑制結腸癌、食管癌和肝癌[19]。醋浸綠變大蒜提取物具有一定的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性，對HL-60人白血病細胞、BGG-823胃癌細胞具有一定的抑制增殖作用[17]。但是目前對綠變大蒜色素的抗肝癌活性研究比較缺乏，本實驗通過大孔樹脂及制備液相色譜分離BP和YP，并進一步分離出了BP-1和YP-3兩種化合物，建立H22荷瘤小鼠模型，觀察BP和YP對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及免疫調節作用，考察BP-1和YP-3對HepG2細胞的抑制增殖作用，為進一步開發綠變大蒜功能食品提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性昆明小鼠，清潔級，體質量（20.0±2.0）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號：SCXK（京）2014-0004。鼠源性H22肝癌細胞，人源性HepG2肝癌細胞均購自上海細胞庫。

大蒜購自天津市南開區市場。

DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）培養基、10%胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 天津百倍生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細胞介素（interleukin-2，IL-2）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒 南京建成生物科技有限公司；環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）（批號15101225） 江蘇盛迪醫藥有限公司；0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水） 河北天成藥業股份有限公司；高效切片石蠟 上海華靈康復器械廠；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染液 天津百倍生物科技有限公司；二硫二硝基苯甲酸 美國Sigma公司；乙醇、正己烷、半胱氨酸（均為分析純） 天津康科德試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

QuikSep LC-10高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 北京慧德易公司；電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司；BDS-200倒置顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BP和YP的分離純化

根據本實驗室前期的研究方法[20]，在室溫下將普通白大蒜用組織破碎器處理成蒜泥，放置30 min。然后用體積分數5%的醋酸充分浸潤，放置于50 ℃烘箱，孵育60 min，升溫至80 ℃后再孵育30 min，蒜泥呈碧綠色時取出。得到的綠變大蒜用體積分數75%乙醇溶液冷浸提取3 次，每次24 h，提取液過濾后，55 ℃真空濃縮得到綠變大蒜乙醇提取物。取預處理好的AB-8大孔樹脂裝柱，將綠變大蒜乙醇提取物溶解在去離子水中上樣，然后用去離子水和體積分數30%、50%乙醇溶液依次洗脫，分別收集在590 nm和440 nm波長處有最大吸收的組分，得到BP和YP。含硫化合物含量測定方法根據改良的Lawson法[21]，BP和YP經過制備HPLC進一步分離純化得到BP-1（純度約為90.2%）和YP-3（純度約為88.6%）。BP和YP中含硫化合物的質量分數分別為（79.21±0.88）%和（73.42±1.59）%。

1.3.2 BP-1和YP-3對HepG2細胞的增殖抑制作用

參考文獻[14]的MTT法，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養HepG2細胞24 h后分別加入BP-1、YP-3（30、60、90、150 μg/mL），用酶標儀進行檢測，檢測波長為490 nm。細胞抑制率根據公式（1）計算。

1.3.3 BP和YP對荷瘤小鼠腫瘤生長狀況、免疫器官指數及水食效率的影響

在無菌條件下取傳代6～7 d的H22肝癌小鼠腹水，用生理鹽水稀釋成含量為1×107個/mL的細胞懸液，于每只小鼠右側腋窩皮下接種0.2 mL。當腫瘤生長到80～100 mm3時視為造模成功并進行以下實驗。

1.3.3.1 動物分組和給藥

將荷瘤小鼠隨機分成8 組，每組10 只，包括模型組（灌胃給予質量分數0.9%的生理鹽水）、陽性對照組（腹腔注射CTX：20 mg/kg）、BP低、中、高劑量組（分別為L-BP：75 mg/kg、M-BP：150 mg/kg、H-BP：300 mg/kg），YP低、中、高劑量組（分別為L-YP：75 mg/kg、M-YP：150 mg/kg、H-YP：300 mg/kg），YP和BP用生理鹽水混懸，灌胃給藥，每天給藥1 次，連續給藥14 d。

1.3.3.2 小鼠水食效率（攝食效率、攝水效率）及腫瘤體積的計算

給藥期間每日測定小鼠的體質量、攝食量及攝水量，分別根據公式（2）、（3）計算小鼠的攝食效率和攝水效率。

每隔2～3 d用游標卡尺測量并記錄腫瘤長和寬，根據式（4）計算腫瘤體積（V）。

式中：L、W分別為腫瘤的長和寬/mm。

觀察不同劑量的BP和YP對荷瘤小鼠的水食效率的影響和給藥期間腫瘤生長體積的變化趨勢，并與模型組和陽性對照組進行對比。

1.3.3.3 抑瘤率、免疫器官指數的計算

給藥第14天，摘除眼球取血，離心收集血清。頸椎脫臼處死小鼠，剝離胸腺、脾、肝臟、腫瘤并稱質量。分別根據公式（5）～（7）計算抑瘤率、胸腺指數和脾臟指數。

1.3.4 BP和YP對荷瘤小鼠中細胞因子水平的影響

取1.3.3.3節中收集的血清，按試劑盒說明書測定各組荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2和VEGF的含量。分析BP和YP對荷瘤小鼠血清中細胞因子水平的影響，考察荷瘤小鼠在給藥后免疫水平的變化情況。

1.3.5 BP和YP對荷瘤小鼠中抗氧化酶和轉氨酶的影響

取1.3.3.3節中剝離的肝臟，制備體積分數10%肝勻漿液，按試劑盒說明書測定各組荷瘤小鼠肝臟中SOD、GSH-Px、CAT、ALT、AST的活力以及MDA含量。

1.3.6 腫瘤組織病理學檢驗

取1.3.3.3節中剝離的腫瘤，用體積分數10%福爾馬林溶液固定，經石蠟包埋、切片、常規H&E染色，在光學顯微鏡放大400 倍下觀察并拍照，分析給藥前后腫瘤組織的病理學變化。

1.4 數據分析

實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。各項指標以平均值±標準差表示，采用t檢驗進行顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 BP和YP分離純化

圖1 BP和YP的洗脫曲線Fig.1 Elution curves of BP and YP

綠變大蒜的色素通過AB-8大孔樹脂分離，體積分數30%乙醇溶液洗脫得到了YP，體積分數50%乙醇溶液洗脫得到了BP，多次收集在440 nm和590 nm波長處有最大吸收的組分，分別得到BP和YP（圖1）。

圖2 BP-1和YP-3的HPLC-質譜圖Fig.2 HPLC-MS profiles of BP-1 and YP-3

制備HPLC繼續分離得到BP-1和YP-3，經過質譜測定其相對分子質量分別為359和365（圖2），推測其分子式分別為C19H17N4O2S和C16H11N2O6S。Kubec等[22]推測綠色素可能是硫代硫酸酯反應的產物。色素提取物可能是多種物質的混合物，包括碳氫化合物、醇類、醛類、酸類、多酚及色素，用大孔樹脂XAD-16或葡聚糖LH-20對色素提取物進行純化。通過C譜和質譜分析并推測其分子式可能為C25H17NO3S、C25H21N3OS、C25H33N3OS、C25H49NOS、C26H21NO2S、C26H37NOS等[14,23]。

2.2 BP-1和YP-3對HepG2的增殖抑制作用

圖3 BP-1和YP-3對HepG2細胞的增殖抑制作用Fig.3 Anti-proliferative effects of BP-1 and YP-3 on HepG2 cells

如圖3所示，BP-1和YP-3對HepG2細胞的生長均具有一定的抑制作用，且BP-1的抑制率最高為75.32%（半數抑制濃度為58.31 μg/mL），抑制作用大于YP-3（P＜0.05）。

2.3 BP和YP對荷瘤小鼠腫瘤生長狀況、免疫器官指數及水食效率的影響

表1 BP和YP對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及臟器指數的影響Table1 Effects of BP and YP on tumor and organ indexes of H22 tumor-bearing mice

由表1可知，BP、YP連續灌胃14 d后，荷瘤小鼠的腫瘤質量高度顯著低于模型組（P＜0.001），L-BP、M-BP、H-BP的抑瘤率分別為43.47%、46.67%和59.85%；L-YP、M-YP、H-YP 3 組劑量對腫瘤生長的抑瘤率分別為29.31%、34.85%、42.36%，呈劑量依賴性。實驗結果表明當BP劑量為300 mg/kg時，具有較好的抑瘤效果，且BP相對YP，對腫瘤的生長抑制作用更明顯。與模型組相比，BP和YP低、中、高3 組劑量均能高度顯著升高其脾臟指數（P＜0.001）；M-BP、H-BP能顯著升高胸腺指數（P＜0.01，P＜0.001），表明BP和YP均能一定程度增強機體免疫功能。與陽性對照組相比，H-BP給藥后脾臟指數極顯著升高（P＜0.01）。

圖4 給予BP和YP 14 d內荷瘤小鼠的腫瘤體積（A）及水食效率（B）Fig.4 Tumor volume (A) and food and water efficiency (B) in response to BP and YP

由荷瘤小鼠的腫瘤體積變化（圖4A）可知，陽性對照組增長速率最慢，M-BP較M-YP變緩。另外，用水食效率來評價荷瘤小鼠生存質量，與BP和YP相比，經CTX治療后的荷瘤小鼠的水食效率高度顯著降低（P＜0.001）（圖4B），說明CTX雖然能夠抑制腫瘤生長，但是會嚴重損害小鼠的健康狀況。而綠變大蒜色素BP、YP可以不同程度地抑制H22荷瘤小鼠的腫瘤生長，并且相對CTX具有較低的毒性，能改善荷瘤小鼠的自身免疫功能和提高生存質量。

2.4 BP和YP對荷瘤小鼠血清中細胞因子水平的影響

細胞因子通過細胞毒的效應細胞直接刺激腫瘤部位的免疫效應細胞和基質細胞，增強腫瘤細胞的識別能力。迄今為止，眾多的動物腫瘤模型研究表明，細胞因子具有廣泛的抗腫瘤活性[24-25]。VEGF能促進內皮細胞增殖，增加細胞外基質合成，使腫瘤血管通透性增加，有利于原位癌向周圍組織蔓延和侵犯促進血管形成，是腫瘤生長過程中的重要因子[26]。由表2可知，與模型組相比，3 個劑量濃度的BP和YP都能夠高度顯著降低VEGF的表達（P＜0.001）。在VEGF的表達上，TNF-α是一種常見的免疫因子，當TNF-α和IL-2表達水平上調時，反映腫瘤生長受到抑制[27]。文獻報道人肝癌細胞BEL7402經大蒜素處理后，對照組人肝癌細胞VEGF與HPRT的比值為（30.16±8.39）%，VEGF的表達明顯降低[28]。與模型組相比，BP 3 個劑量組的IL-2和TNF-α質量濃度顯著升高（P＜0.05），H-BP對這2種細胞因子的表達水平的提高效果最為顯著（P＜0.001）；結果表明，BP和YP可以促進TNF-α和IL-2的分泌，抑制VEGF的表達，提高機體免疫水平。

表2 BP and YP對H22荷瘤小鼠血清中VEGF、IL-2和TNF-α質量濃度的影響Table2 Effects of BP and YP on VEGF, IL-2 and TNF-α levels in serum of H22 tumor-bearing mice pg/mL

2.5 BP和YP對荷瘤小鼠肝臟中SOD﹑CAT﹑GSH-Px、MDA和轉氨酶的影響

表 3 BP和YP對H22荷瘤小鼠肝臟中CAT、GSH-Px、SOD、ALT、AST活力和MDA含量的影響Table3 Effects of BP and YP on CAT, GSH-Px, SOD, ALT and AST activities and MDA contents in liver of H22 tumor-bearing mice

GSH-Px、CAT和SOD是哺乳動物細胞中的關鍵抗氧化酶，酶活力的升高一定程度上反映了藥物對肝臟的保護作用。如表3所示，與模型組相比，陽性對照組及BP、YP各劑量組SOD、CAT、GSH-Px活力顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），MDA含量高度顯著降低（P＜0.001）；與陽性對照組相比，M-BP和H-BP的SOD、CAT﹑GSH-Px活力高度顯著升高（P＜0.001）。與模型組相比，陽性對照組ALT和AST的活力極顯著升高（P＜0.01），反映出化療藥CTX對小鼠肝腎的損害[29]。機體的SOD、GSH-Px、CAT等酶具有清除氧自由基的能力，對機體起保護作用，能減少氧化損傷[30-31]。結果表明BP和YP干預后，肝臟氧化應激水平降低，表現出對肝臟的保護效果，而CTX雖然能夠顯著抑制腫瘤生長，但是對肝臟損害較大。

2.6 腫瘤組織病理學分析

圖5 腫瘤組織的病理切片（400×）Fig.5 Histopathological studies of tumor tissues (400 ×)

H&E染色的腫瘤組織病理分析結果（圖5）表明，給藥后大量細胞呈現出壞死狀態。與模型組相比，給藥組的腫瘤細胞表現出稀疏的粉紅色的細胞質，細胞縮小或消失，細胞核染色變淺且排列疏松。腫瘤周邊可見血管、纖維組織增生，少量炎細胞浸潤。

3 討 論

關于綠變大蒜的藥理活性研究還處于初級階段，本實驗探究了綠變大蒜色素對腫瘤的抑制作用。大蒜綠變色素分離得到的BP和YP可以不同程度地抑制H22荷瘤小鼠的生長，且BP對腫瘤的抑制作用較YP更強。BP和YP不僅改善了H22荷瘤小鼠的生存質量，增加肝臟中GSH-Px、CAT和SOD的活力，降低MDA的含量，增強機體免疫力和抗氧化水平，且對肝臟的損害相較化療藥較低。同時通過調節細胞因子水平，推測其抗腫瘤作用可能是通過抑制VEGF的活性，影響腫瘤血管形成；也可能是提高了IL-2和TNF-ɑ的水平來抑制腫瘤生長。BP和YP進一步分離的化合物BP-1和YP-3對HepG2細胞的具有較強的增殖抑制作用，這也表明了綠變大蒜具有體外抗癌活性。研究發現，大蒜中富含有機硫化物，綠變大蒜色素更是大蒜中硫化物的互相轉換產物，大蒜綠變成綠蒜的過程中，有多種酶參與反應包括γ-谷氨酰轉肽酶和蒜氨酸酶，產生醚溶性的有機硫化物，色素前體物質如-1-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜。同時，大蒜中的硫代亞磺酸酯也參與大蒜綠變反應。這些含硫化合物是大蒜中主要的抗癌活性物質，推測也可能是綠變大蒜色素的成分之一。研究發現飲食中含有的大蒜類成分可以降低罹患各類惡性腫瘤的風險。但是目前缺乏對色素結構的準確鑒定以及抗癌機制的深入探討，因此還需要進行更多的相關實驗，為開發綠變大蒜色素及其作為功能食品提供參考。