長期槲皮素膳食暴露對小鼠乳腺發(fā)育的影響

閔佳玲，許春蓮，舒 翔，邱奇琦，聶少平，謝明勇，胡曉鵑,2,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西 南昌 330006）

植物雌激素是一大類植物源性的天然化合物，廣泛存在于人類的日常食材當(dāng)中[1]。由于它們的結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的雌激素結(jié)構(gòu)類似，在人體內(nèi)可激活相應(yīng)的受體以發(fā)揮雌激素類生物學(xué)效應(yīng)[2]。目前研究表明，植物雌激素從本質(zhì)上是一種內(nèi)分泌干擾物，其不當(dāng)攝入極有可能打破原有的生殖內(nèi)分泌平衡狀態(tài)，從而引發(fā)相關(guān)的負(fù)面效應(yīng)[3]。研究其對于人群健康的影響，尤其是對于內(nèi)源性雌激素水平較低且肝臟生物轉(zhuǎn)化能力較弱的未成年個(gè)體的影響，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

槲皮素屬于植物雌激素中的黃酮類物質(zhì)，以多種β-糖苷的形式存在于許多日常食用蔬菜及水果中，其人群攝入平均水平較高（每日攝入量為10～20 mg）[4]。因此，日常膳食所引發(fā)的槲皮素?cái)z入對于人體健康的影響日益為人們所關(guān)注。

乳腺組織作為典型的雌激素敏感性組織，其發(fā)育過程自然極可能會(huì)受到激素樣物質(zhì)不當(dāng)攝入的負(fù)面影響[3,5]。本研究中，以21 日齡雌性小鼠為模型，考察長期膳食水平槲皮素?cái)z入對于其乳腺組織發(fā)育的影響，期望能從整體動(dòng)物水平客觀評價(jià)槲皮素長期攝入對于圍青春期乳腺發(fā)育過程的潛在影響，為相關(guān)食品安全預(yù)警提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

清潔級2 1 日齡雌性昆明小鼠3 6 只（體質(zhì)量10～13 g；許可證號：SCXK（湘）2016-0002），購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

小鼠飼料（不含植物雌激素） 北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料公司；槲皮素（純度＞99%）、異鼠李素（純度＞99%）；葡聚糖凝膠、胰脂肪酶、葡萄糖醛酸酶、硫酸酯酶 美國Sigma-Aldrich公司；雌激素受體（estrogen receptor，ER）α及ERβ一抗、孕激素受體（progesterone receptor，PR）一抗、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）一抗 美國Abcam公司；山羊抗兔過氧化物酶標(biāo)記染色試劑盒、辣根過氧化物酶（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、蘇木精北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈、甲酸、二甲基亞砜、乙酸銨、乙酸乙酯、正己烷、氯仿 上海振興化工一廠。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight/mass spectrometry，HPLC-Q-TOF/MS） 美國Agilent公司；超純水儀 美國Milipore公司；冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；電子天平 梅特勒-托利多（上海）公司；離心機(jī)上海安亭離心機(jī)廠；氮吹儀 北京成萌偉業(yè)科技有限公司；組織勻漿器 上海標(biāo)本磨具廠；數(shù)顯雙列四孔恒溫水浴鍋 金壇市岸頭良友實(shí)驗(yàn)儀器廠；脫水機(jī)、半自動(dòng)切片機(jī) 德國Leica公司；病理組織包埋冷凍臺、病理組織漂烘儀 常州市中威電子儀器有限公司；超低溫冰箱 青島海爾股份有限公司；顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與處理

室溫（20±1）℃，12 h/12 h明暗交替，自由飲食。為了避免常規(guī)小鼠飼料當(dāng)中豆源性原料對于實(shí)驗(yàn)的干擾，全過程采用不含植物雌激素的特殊飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。將剛斷奶的21 日齡雌性小鼠隨機(jī)分為4 組（9 只/組）：槲皮素高、中、低劑量組（暴露劑量分別為45、25、5 mg/（kg·d））以及空白對照組（二甲基亞砜0.1 mL/d）。對小鼠進(jìn)行灌胃，每日1 次。直至小鼠性成熟并出現(xiàn)3 次以上具有規(guī)律性的生殖周期，共連續(xù)灌胃50 d。待小鼠陰道口開張即性成熟后，以陰道涂片形式觀測其生殖周期變化。擇發(fā)情期于末次灌胃4 h后脫臼處死小鼠。收集血漿樣本以及乳腺組織，以HPLC-Q-TOF/MS分析槲皮素相關(guān)代謝物分布狀況，以免疫組織化學(xué)方法檢測小鼠乳腺上皮細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)（ERα、ERβ、PR、PCNA）表達(dá)水平。

1.3.2 組織樣本檢測前處理

取300 μL血漿或乳腺組織生理鹽水勻漿液，先后加入10 μL香葉木素溶液（10 μg/mL）、2 mL乙酸乙酯，漩渦混勻后3 000 r/min離心5 min，反復(fù)萃取4 次，合并上清液，氮?dú)獯蹈伞⒋蹈蓸悠芬?0 μL甲醇+300 μL正己烷-氯仿（體積比1∶1）復(fù)溶，上葡聚糖凝膠柱。以6 mL正己烷-氯仿（體積比1∶1）洗脫即為脂溶相，再用5 mL甲醇洗脫即為水溶相，將兩相樣本以氮?dú)鈸]干，分別進(jìn)行處理。

正己烷相：以200 μL甲醇復(fù)溶，加入1 g/100 mL脂肪酶溶液150 μL，37 ℃水浴酶解4 h，2 mL乙酸乙酯漩渦混勻，3 000 r/min離心5 min，萃取4 次，合并上清液，氮?dú)獯蹈伞Ｒ?00 μL甲醇復(fù)溶過濾膜，進(jìn)樣檢測。

甲醇相：以200 μL甲醇復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH值至4.9，漩渦混勻，加入5 μL β-葡萄糖醛酸酶和5 μL硫酸酯酶，漩渦混勻，在37 ℃水浴密閉酶解過夜。加入2 mL乙酸乙酯漩渦混勻，3 000 r/min離心5 min，萃取4 次，合并上清液，氮?dú)獯蹈伞Ｒ?00 μL甲醇復(fù)溶過濾膜，進(jìn)樣檢測。

1.3.3 槲皮素以及其代謝產(chǎn)物異鼠李素的組織分布狀況檢測

參考文獻(xiàn)[6]的方法采用HPLC-Q-TOF/MS法檢測槲皮素及其代謝產(chǎn)物異鼠李素的組織分布狀況。色譜條件：C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～1 min，10%～35% B；1～3 min，35% B；3～6 min，35%～80% B；6～8 min，80% B；8～9 min，80%～10% B；9～10 min，10% B；檢測波長360、260 nm；柱溫30 ℃；流速0.35 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：使用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），在負(fù)離子模式下分別采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍m/z 50～2 000；ESI參數(shù)：氣化室溫度350 ℃，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣（N2）體積流量10 L/min，裂解電壓180 V；定性離子：m/z 301、315。

1.3.4 乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ER、PR以及PCNA表達(dá)水平檢測

取乳腺組織以中性福爾馬林固定12 h，常規(guī)梯度乙醇溶液脫水至組織呈透明，石蠟包埋并切片（厚度5 μm）。按照經(jīng)典的SP法免疫組化方法進(jìn)行操作，嚴(yán)格按照相關(guān)試劑說明書進(jìn)行染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，置于檸檬酸鈉緩沖液中以高壓鍋加熱加壓修復(fù)抗原；以體積分?jǐn)?shù)3% H2O2浸泡封閉內(nèi)源性過氧化物并以正常山羊血清工作液（體積分?jǐn)?shù)7.5%）封閉，直接分別滴加一抗工作液ERα（1∶75）、ERβ（1∶75）、PR（1∶200）或PCNA（1∶250），4 ℃冷藏孵育過夜，磷酸鹽緩沖液清洗后滴加生物素偶聯(lián)山羊抗兔二抗工作液（1∶1 000）孵育25 min（37 ℃），辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，孵育25 min（37 ℃），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水-透明-中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，選取每個(gè)樣本3 張切片，每張切片取5 個(gè)400 倍鏡視野統(tǒng)計(jì)結(jié)果，其中DAB顯色呈褐色為陽性，而陰性染色細(xì)胞核因經(jīng)過蘇木精復(fù)染而呈現(xiàn)出藍(lán)色。結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)：參照Remmele等[6]的免疫化學(xué)評分體系（immunohistochemical response score，IRS），采用染色強(qiáng)度（staining intensity，SI）和陽性細(xì)胞百分比（percentage of positively stained glands，PP）的乘積，即IRS＝SI×PP。SI分為4級：0級為未見陽性細(xì)胞即陰性，1級弱陽性，2級中等陽性，3級強(qiáng)陽性。PP分為5級：0級為陰性，1級≤25%，2級25%～50%，3級50%～75%；4級≥75%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 血漿及乳腺中槲皮素以及其代謝產(chǎn)物的含量檢測

本團(tuán)隊(duì)前期已建立并報(bào)道了生物樣本中槲皮素相關(guān)代謝產(chǎn)物的檢測方法，在信噪比為3時(shí)檢出限可低至1 ng/mL且重復(fù)性佳[7]。以槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X）對峰面積積分值（Y）進(jìn)行線性回歸，在脂溶相以及水溶相中槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣在0.002～2 000 μg/mL范圍內(nèi)均與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（表1）。

表1 各組織洗脫相中的槲皮素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table1 Linear regression equations with coefficients of correlation for quercetin and isohamnetin dissolved in various phases

血漿以及乳腺組織局部的槲皮素相關(guān)代謝物含量與動(dòng)物模型的槲皮素?cái)z入量存在典型的劑量依賴性關(guān)系。不論是脂肪酸酯類產(chǎn)物還是結(jié)合型硫酸酯或葡萄糖醛酸酯類代謝產(chǎn)物在乳腺組織當(dāng)中的含量均明顯大于血漿組織，體現(xiàn)出了顯著的組織富集效應(yīng)（表2）。尤其是水溶性結(jié)合型代謝產(chǎn)物，乳腺組織局部濃度均值可達(dá)到血漿濃度的30 倍以上。提示乳腺組織對于槲皮素的暴露較為敏感。此外，在灌胃4 h后血漿中以槲皮素脂肪酸酯為主，而在乳腺組織內(nèi)以水溶性結(jié)合型槲皮素代謝產(chǎn)物為主。

表2 各組織中槲皮素各類代謝產(chǎn)物分布Table2 Distribution of quercetin metabolites

2.2 長期槲皮素暴露對于乳腺上皮細(xì)胞PCNA表達(dá)水平的影響

PCNA是描述組織細(xì)胞增殖水平的經(jīng)典指標(biāo)，以其為靶點(diǎn)可較為客觀地評價(jià)乳腺上皮細(xì)胞增殖的狀況。IRS評分結(jié)果顯示圍青春期的槲皮素長期攝入并沒有直接改變雌性小鼠成年后乳腺上皮的增殖狀況，與組織分析結(jié)果相一致（圖1）。

圖1 乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.1 IHC staining of PCNA

2.3 長期槲皮素暴露對于乳腺上皮細(xì)胞ERα以及ERβ表達(dá)水平的影響

為考察槲皮素是否影響小鼠成年后乳腺上皮細(xì)胞對于生殖內(nèi)分泌相關(guān)激素的敏感性，進(jìn)一步分析了乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ER的表達(dá)狀態(tài)。

圖2 ERα免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.2 IHC staining of ERα

圖3 ERβ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.3 IHC staining of ERβ

局部組織ERα以及ERβ的表達(dá)水平和表達(dá)比例直接影響組織對于相關(guān)激素和激素類似物的反應(yīng)性。經(jīng)免疫組織化學(xué)染色分析，低劑量組槲皮素長期暴露后明顯可誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ERα表達(dá)（圖2），而與ERα相反，乳腺上皮細(xì)胞ERβ的表達(dá)受到抑制（圖3）。由此乳腺組織上皮細(xì)胞內(nèi)ERα與ERβ表達(dá)水平的比值被顯著上調(diào)。需要說明的是，這些效應(yīng)在中、高劑量組中并沒有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4 長期槲皮素暴露對于乳腺上皮細(xì)胞PR表達(dá)水平的影響

圖4 PR免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Fig.4 IHC staining of PR

PR是ER通路下游的重要分子指標(biāo)，在乳腺組織的生長發(fā)育以及分化過程中起到非常重要的作用[8]。免疫組織化學(xué)染色分析顯示，PR的表達(dá)明顯受到了槲皮素長期暴露的阻遏，在中、低劑量組乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)PR表達(dá)量顯著低于空白對照組（圖4）。

3 討 論

近年來，乳腺癌以及乳腺相關(guān)疾病的發(fā)病率逐年上升，已成為危害女性健康的重要因素之一[9]。有研究報(bào)道表明，在幼年期內(nèi)分泌干擾物的不當(dāng)攝入會(huì)影響乳腺等激素敏感性組織的發(fā)育，并可能提高個(gè)體成年后罹患相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)[3]。

槲皮素是正常膳食中廣泛存在的黃酮類活性物質(zhì)[10]。由于許多研究報(bào)道表明其具有一定的抗氧化、抗腫瘤等生物學(xué)活性，因此富含槲皮素成分的膳食一直為人們所推崇[11-12]。然而需要指出的是槲皮素同時(shí)也可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)激活ER相關(guān)通路從而表現(xiàn)出類雌激素樣活性，屬于植物雌激素的范疇[13]。幼兒階段的個(gè)體，由于乳腺等雌激素敏感性組織處于發(fā)育階段且個(gè)體本底生殖內(nèi)分泌激素水平較低，對于外源性雌激素樣內(nèi)分泌干擾物的攝入尤其敏感[14]。為客觀評價(jià)膳食源性槲皮素對于人體健康的影響，在本研究中，以前期槲皮素膳食攝入水平評估原始數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，選擇相對較低的膳食暴露劑量，客觀評價(jià)在圍青春期這一生長發(fā)育敏感階段槲皮素的長期膳食攝入對于乳腺發(fā)育的影響。

研究結(jié)果提示：盡管在本研究考察劑量范圍（5～45 mg/（kg·d））內(nèi)，圍青春期槲皮素的長期暴露并沒有明顯影響到成年雌性個(gè)體乳腺組織結(jié)構(gòu)以及乳腺上皮細(xì)胞的增殖狀況，但是乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ER的表達(dá)譜已發(fā)生了顯著性的改變，ERα表達(dá)上調(diào)而ERβ表達(dá)下調(diào)，ERα與ERβ表達(dá)水平比值明顯上升，且PR的表達(dá)也受到阻遏。這一現(xiàn)象與其他研究團(tuán)隊(duì)關(guān)于染料木素等其他植物雌激素影響ER表達(dá)譜的報(bào)道相似[15-16]。

值得一提的是，槲皮素的生物學(xué)效應(yīng)特點(diǎn)與染料木素等其他植物雌激素相類似，呈現(xiàn)出雙向“U”型效應(yīng)，即在高劑量水平與低劑量水平下可表現(xiàn)出截然不同的甚至相反的生物學(xué)活性[17]。從本研究的數(shù)據(jù)中不難看出：槲皮素在中低劑量組中顯示出了更為顯著的生物學(xué)效應(yīng)，而不是高劑量組，這并不符合常規(guī)的效量關(guān)系，這一現(xiàn)象與其他植物雌激素類物質(zhì)的生物學(xué)活性研究結(jié)果相一致[17]。

部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道槲皮素能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，可作為預(yù)防或治療乳腺癌的有效化合物[18-19]，但其效果的產(chǎn)生往往需要較高的作用濃度（20～60 μmol/L）。需要說明的是，這一濃度水平通過正常的膳食攝入幾乎是不可能達(dá)到的。而Singh等[20]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明槲皮素可能會(huì)加劇雌性ACI大鼠中雌二醇（E2）誘導(dǎo)的乳腺腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，因此槲皮素可能提高了乳腺組織對于E2促增殖效應(yīng)的敏感性，與本研究中槲皮素暴露會(huì)上調(diào)小鼠成年后乳腺組織內(nèi)ERα/β表達(dá)比結(jié)果相符。

眾所周知，ER、PR是相關(guān)生殖內(nèi)分泌激素作用的主要靶分子，其在局部組織的表達(dá)水平可明顯影響相應(yīng)組織對于相關(guān)激素以及激素樣活性物質(zhì)的反應(yīng)性，也極可能會(huì)影響到個(gè)體對于相關(guān)疾病致病因素的敏感性[21]。ER主要分為結(jié)構(gòu)類似但生物功能相對獨(dú)立又彼此緊密聯(lián)系的ERα以及ERβ兩大亞型[22]。相關(guān)研究報(bào)道提示，ERβ可負(fù)向調(diào)控ERα介導(dǎo)的相關(guān)敏感性組織/細(xì)胞增殖的生物學(xué)過程，在組織分化以及乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中起到了非常重要的作用[23]。此外，PR的表達(dá)也可從一定程度上抑制乳腺發(fā)育過程中組織增殖并促進(jìn)分化[24]。在本研究中，槲皮素在圍青春期的不當(dāng)暴露提高了個(gè)體成年后乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ERα/β表達(dá)比值，抑制了促進(jìn)乳腺組織發(fā)育分化的PR表達(dá)，極可能提高乳腺組織對于促進(jìn)其增殖、誘發(fā)其異常增生等各因素的敏感性，從而升高相應(yīng)個(gè)人罹患相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

需要說明的是：槲皮素不僅通過直接作用于激素敏感性組織本身，而且可能通過影響機(jī)體內(nèi)整體的生殖內(nèi)分泌平衡，來引發(fā)一系列的負(fù)面效應(yīng)[25-26]。由此，槲皮素膳食攝入所可能引發(fā)的潛在危害，尤其是針對處于生長發(fā)育階段的嬰幼兒及青少年，應(yīng)該給予重視。

此外，本團(tuán)隊(duì)前期建立的化學(xué)分析方法可以在相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品缺乏的情況下，通過相應(yīng)酶類的生物水解，精確分析槲皮素生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的相應(yīng)代謝物[7]。數(shù)據(jù)顯示，槲皮素在動(dòng)物體內(nèi)不僅可轉(zhuǎn)化為水溶性的硫酸酯以及葡萄糖醛酸酯類結(jié)合產(chǎn)物，還可以轉(zhuǎn)化為脂溶性的脂肪酸酯類產(chǎn)物。各類槲皮素代謝產(chǎn)物的組織內(nèi)局部分布均呈現(xiàn)出劑量依賴性關(guān)系。需要特別關(guān)注的是，在乳腺組織中槲皮素相應(yīng)代謝產(chǎn)物的含量均明顯高于血漿組織，體現(xiàn)出顯著的乳腺組織局部富集作用，因此，相對而言乳腺組織對于槲皮素的攝入更為敏感。由此也表明，單純以血漿當(dāng)中相應(yīng)代謝產(chǎn)物濃度為關(guān)注劑量，在細(xì)胞水平上討論槲皮素對于個(gè)體各組織器官的影響具有一定的局限性。

4 結(jié) 論

本研究以圍青春期雌性小鼠為模型從整體動(dòng)物水平證實(shí)：乳腺對于槲皮素暴露具有較高的敏感性，槲皮素的長期暴露引發(fā)其相應(yīng)代謝產(chǎn)物在乳腺組織當(dāng)中進(jìn)行局部富集；小鼠成年后乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)各生殖內(nèi)分泌激素受體表達(dá)譜可被槲皮素暴露所干擾。在5 mg/（kg·d）劑量水平下，槲皮素可顯著上調(diào)乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ERα與ERβ表達(dá)水平比值并且明顯抑制PR表達(dá)，改變?nèi)橄俳M織對于生殖內(nèi)分泌激素以及其外源類似物的敏感性，從而影響相應(yīng)個(gè)體成年后罹患乳腺相關(guān)疾病的可能性。