四川地區山羊源沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析

張毅 ，王英 ，黃忍 ，李英林 ，邵靚 ，趙尊福

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041；3.四川省涼山州動物疫病預防控制中心，四川 西昌 615000）

沙門菌是一種革蘭氏陰性桿菌，是最常見的人畜共患食源性致病菌之一。沙門菌引起的細菌性食物中毒高達70%～80%[1]，消費者食用感染沙門菌的食物后，常表現出嘔吐、腹瀉、惡心、持續高熱等癥狀[2]。目前國內對沙門菌的研究多集中在禽類及豬、牛等動物上，而鮮有關于山羊源沙門菌的報道。

沙門菌對各年齡段的山羊都能致病，對羔羊的危害最嚴重，臨床上主要以敗血癥、胃腸炎、下痢為主要特征。王晶晶等[3]對四川省部分地區表觀健康山羊的糞便進行了沙門菌的分離鑒定，結果顯示山羊沙門菌的平均帶菌率高達54.59%。山羊攜帶沙門菌不僅僅導致自身發病，還會污染山羊的奶制品、肉制品，引發食源性中毒。本研究對四川地區226份山羊糞便樣本進行了沙門菌的分離鑒定，并對分離出來的菌株進行藥敏分析，旨在了解四川地區山羊沙門菌的攜帶情況及耐藥情況。

1 材料

1.1 菌株 本試驗所用沙門菌（Salmonella）標準株CVCC528由西南民族大學動物醫學實驗室保存。

1.2 樣本來源 從四川樂至、南江、金堂、青白江、攀枝花5個地區采集了158份山羊腹瀉糞便樣本和68份健康山羊糞便樣本，共計226份（表1）。

表1 山羊糞便樣本來源 份

1.3 主要試劑 Premix Taq、DL2000 DNA Marker，均購自TaKaRa公司；BPW培養基、SS瓊脂培養基、四硫磺酸鈉亮綠培養基（TTB），均購自青島海博生物技術有限公司；電泳瓊脂糖，購至OXOID公司；頭孢拉定、頭孢噻吩、氨芐青霉素、頭孢噻肟、阿莫西林、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、羅紅霉素、大觀霉素、四環素、氟苯尼考、恩諾沙星、環丙沙星、復方新諾明、萬古霉素、替考拉寧和丁胺卡那霉素18種藥敏片，購自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 引物合成 引物為參考文獻[4]中的一對特異性檢測沙門菌invA基因的引物，上游引物：5′-GTGAAA TTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′，下游引物：5′-TCAT CGCACCGTCAAACCAACC-3′，引物長度為289 bp，由生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 細菌的分離純化 取約1g糞便樣品用無菌生理鹽水稀釋至1mL，充分振蕩混勻后取500μL接種于BPW增菌液中，37℃恒溫培養24 h；然后取1mL BPW增菌液接種于10mL TTB選擇性增菌液中，37℃恒溫培養24h，無菌環境下劃線接種于SS瓊脂培養基平板，37℃恒溫培養24h；觀察菌落形態，挑取疑似沙門菌菌落進行純培養。

2.2 分離菌的PCR鑒定 先用酚氯仿法提取分離菌DNA，再用特異性PCR對分離菌進行鑒定。PCR反應體系（20μL）：DNA模板2μL，上、下游引物各1μL，Premix Taq 10μL，ddH2O 6μL；PCR 反應條件：95℃預變性 5 min；95℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸40s，共40個循環；72℃再延伸10min。PCR產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并隨機抽取4份PCR陽性產物送生工生物工程有限公司測序，再將測序結果在GenBank上比對。

2.3 藥敏分析 參照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）2009年藥敏試驗標準，采用紙片擴散法對分離菌進行藥敏分析。取0.5麥氏單位菌液（含菌量為 1×105～2×105CFU/mL）500μL，均勻涂布于 MH 藥敏瓊脂平板上，貼上藥敏片，37℃恒溫培養18h后測定抑菌圈直徑。

3 結果

3.1 細菌分離鑒定結果 結果顯示：158份腹瀉糞便樣本中，沙門菌的分離率為15.2%（34/158）；68份健康糞便樣本中，沙門菌的分離率為11.8%（8/68）；樣本總分離率為14.2%（32/226）（表2）。隨機抽取4份PCR陽性產物測序結果與GenBank Blast比對，證實是沙門菌invA基因特異性片段。

表2 226份糞便樣本中沙門菌的檢出率

3.2 藥敏試驗結果 所分離的32株沙門菌對頭孢拉定、頭孢噻吩、頭孢噻肟、慶大霉素、大觀霉素和丁胺卡那霉素的敏感率均為100%，對卡那霉素、恩諾沙星、環丙沙星、復方新諾明和替考拉寧有不同的耐藥性（耐藥率為21.9%～78.1%），對四環素、鏈霉素、羅紅霉素、氟苯尼考、萬古霉素、氨芐西林和阿莫西林完全不敏感（表3）。

4 討論

目前檢測沙門菌的目標基因有invA、ompC、ssrA、sefA、pefA等，特異性最強的有sefA、pefA和invA。sefA和pefA是檢測鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌的特異性基因，腹瀉糞便中沙門菌的血清型很多，為防止漏檢，需采用沙門菌屬共有的特異性基因為目標基因，而invA基因序列為沙門菌屬所共有。本研究選擇沙門菌的侵襲蛋白基因invA為目標基因，合成一對特異性引物，然后對分離的沙門菌進行PCR鑒定，特異性好，鑒定結果可靠。

表3 32株沙門菌的耐藥性試驗結果

沙門菌的耐藥機制主要包括基因突變引起的耐藥、細菌外排作用引起的耐藥、質粒介導的耐藥等[5]。因基因突變引起沙門菌產生耐藥性主要體現在兩方面：抗生素靶基因突變與基因錯配修復系統突變。沙門菌通過改變抗生素靶基因表達產物的空間結構而使抗菌藥物無法識別位點，從而產生耐藥性[6]。目前，喹諾酮類藥物是臨床上治療腸道致病菌感染的首選藥物，但Rushdy A A等[7]研究報道：27000株沙門菌分離株中，有13%對氟喹諾酮類藥物耐藥。本研究分離的沙門菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率高于Rushdy A A等的報道。耐藥性的產生還與臨床上抗生素的不規范使用，以及質粒攜帶的耐藥基因擴散耐藥性有關[8]。