上皮鈉離子通道阻滯劑阿米洛利對雌性大鼠骨代謝的影響

張延嬌 陳 博

(廣東醫科大學基礎醫學院生理科學實驗室，廣東 東莞 523808)

雌激素在維持雌性骨代謝平衡中起重要作用。研究證實雌激素的生物學功能主要由雌激素受體(ER)介導，而骨細胞上的ER數量很少，且雌激素與ER的結合率也很低〔1～3〕。雌激素在體內的代謝除雌激素經典途徑，還存在替代通路〔4～6〕，目前雌激素影響骨代謝的機制尚未完全闡明。離子通道是細胞間相互通信和傳送電信號的便利途徑。上皮鈉離子通道(ENaC)具有多方面的生理功能，包括酸感受、維持鈉平衡和感應傳導機械應力刺激。研究表明ENaC表達存在性別差異，雌激素能調節和影響腎臟、肺、子宮等器官鈉通道蛋白或ENaC亞單位基因表達〔7～9〕，并影響ENaC生理作用(如子宮水鈉潴留，血壓等)。ENaC在成骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞上都有分布。研究證實ENaC參與骨代謝，在成骨細胞中ENaC參與雌激素促進骨形成過程，雌激素的促成骨作用能被ENaC阻滯劑阿米洛利(Ami)抑制〔10〕。Ami處理破骨細胞后，細胞上ENaC表達減弱，同時抑制破骨細胞的形成，表明ENaC影響骨吸收〔11,12〕。本文探討ENaC受體阻滯劑Ami對不同雌激素水平下骨代謝的影響。

1 材料和方法

1.1試驗動物 3月齡雌性SD大鼠〔廣東省南方醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2011-0015〕40只，SPF級，體重160～180 g。適應性喂養1 w后開始實驗。

1.2試驗藥品與試劑 鹽酸Ami(純品)粉劑；堿性磷酸酶試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)；N端骨鈣素(N-MID)(100T)檢測試劑盒(德國羅氏，批號：17233501)；CalsetN-MID定標液(L&H，德國羅氏，批號：17225901)；雌二醇(E2)(100T)檢測試劑盒(德國羅氏，批號：17207803)；CalsetE2定標液(德國羅氏，批號：17286601)。

1.3動物造模與分組 隨機數表法將大鼠分成5組，每組8只，分別為基礎對照組、假手術組、假手術組+Ami組、去卵巢組、去卵巢+Ami組。基礎對照組適應性喂養后，于實驗初始時處死取材。實驗中以2‰羧甲基纖維素鈉作為助懸劑。假手術+Ami組和去卵巢組+Ami組Ami給藥劑量為10 mg·kg-1·d-1，假手術組和去卵巢組給等體積2‰羧甲基纖維素鈉溶液，灌胃給藥8 w。

1.4實驗方法 各組每7 d稱重1次，以測定時間為橫坐標，體重為縱坐標，繪制生長曲線。應用堿性磷酸酶(ALP)試劑盒測ALP，N-MID、E2采用電化學發光法測定，具體步驟按說明書操作。處理好的股骨標本沿長軸垂直固定于樣品固定器內。vivaCT 40選擇掃描參數：圖像矩陣為1 024×1 024，能量/強度為70 kVp、114 μA、8 W。選取距生長板遠端1.0 mm、層厚3.0 mm的骨組織為感興趣區域行三維重組，獲得重組圖像后使用micro-CT自帶軟件定量分析。

1.5統計方法 采用SPSS13.0軟件進行正態分布檢驗、非參數檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1ENaC阻滯劑Ami對雌性大鼠體重的影響 與假手術組比較，大鼠去卵巢2 w后體重呈顯著性增加(P<0.05，P<0.01)。而假手術組和假手術+Ami組體重僅表現出正常增長。Ami對體重無影響。見表1。

表1 各組體重比較

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01;3)因操作失誤1只大鼠死亡

2.2鹽酸Ami對骨量的影響 與基礎對照組比較：假手術組骨體積(BV)、骨總量(TV)顯著增加(P<0.01)，骨小梁分離度(Tb.Sp)顯著性降低(P<0.05)，表明隨著實驗進程股骨在生長。與假手術組比較：去卵巢組BV、BV/TV、骨小梁數量(Tb.N)明顯降低，Tb.Sp明顯增高(P<0.01)，提示生長期大鼠去卵巢2個月能夠成功建立骨質疏松模型；假手術+Ami組BV明顯增加(P<0.01)，BV/TV、Tb.N、Tb.Th均增高，而Tb.Sp降低，且差異均無統計學意義(P>0.05)，提示Ami對正常大鼠骨量無影響。與去卵巢組比較，去卵巢+Ami組BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均顯著降低(P<0.01)，而TV、Tb.Sp顯著增高(P<0.05，P<0.01)，提示Ami加劇去卵巢大鼠的骨丟失。見表2、圖1、2。

表2 各組骨量比較

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與去卵巢組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；5)因操作失誤1只大鼠死亡；下表同

圖1 各組microCT股骨下段的三維重建

圖2 各組microCT股骨下段縱切面

2.3鹽酸Ami對血清激素的影響 與假手術組比較：基礎對照組血清E2、ALP、N-MID水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，去卵巢組和去卵巢+Ami組血清E2水平顯著性下降(P<0.05，P<0.01)，N-MID顯著增高(P<0.05)。表現出高骨轉換過程中骨形成活躍。見表3。

表3 各組血清激素水平比較

3 討 論

絕經后骨質疏松主要是雌激素水平下降導致骨吸收和骨形成失去動態平衡而出現的代謝性骨病，屬于老年病范疇。ENaC是許多藥物作用的靶點，受多種激素和藥物調節〔10〕。體外實驗證實，雌激素促進成骨細胞增殖和成骨相關基因表達，同時上調ENaC mRNA表達,應用LNaC阻滯劑能阻斷雌激素的促成骨作用，提示ENaC參與雌激素調節下成骨作用〔9〕。ENaC也參與調控破骨細胞分化和骨吸收過程〔12〕，在關節炎和骨質疏松的發病過程中起作用，可能是防治骨質疏松的新靶點。

Ami是臨床應用的一種保鉀利尿劑，可以抑制鈉離子通道、質子通道、一些鈉離子相關轉運體(Na+-H+反向轉運體、Na+-Ca2+交換體)等多個離子通道。Ami常常作為非特異性鈉離子通道阻滯劑，在基礎研究中,也常作為一種藥理學工具被廣泛應用。體外對破骨細胞實驗證實，Ami能夠抑制破骨細胞內ENaC表達，抑制破骨細胞的分化和骨吸收；同時也有實驗表明Ami能抑制雌激素的促成骨作用〔10,12〕。骨代謝是骨形成和吸收相互耦聯的動態過程，本實驗結果表明Ami能加劇去卵巢所致高骨轉換狀態下的骨丟失，而對假手術組骨量無明顯影響，但實驗中無論假手術大鼠還是去卵巢大鼠，Ami均未表現出對骨形成的影響，推測可能是直接或間接影響骨吸收過程影響骨代謝，尚需進一步實驗證實。