當(dāng)歸四逆湯對(duì)大鼠DPN抑制作用及AGEs/RAGE的調(diào)節(jié)

周曉晶 李 欣 柳燁惠 姜麗娟 劉 紅 程思宇 邢日新 明容美 張文風(fēng)

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130017)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是一種進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙，臨床表現(xiàn)是遠(yuǎn)端周圍神經(jīng)對(duì)稱性退化，間歇性持久肢體疼痛和喪失感覺〔1〕，可發(fā)生潰瘍甚至導(dǎo)致截肢〔2〕，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。臨床研究已發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸四逆湯能有效改善DPN患者主觀神經(jīng)癥狀，改善膝、跟腱反射及神經(jīng)傳導(dǎo)速度〔3〕，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討。現(xiàn)已明確，糖尿病時(shí)過高的血糖可轉(zhuǎn)化為糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)積聚于周圍神經(jīng)組織，當(dāng)與AGEs受體(RAGE)結(jié)合后可啟動(dòng)下游信號(hào)通路干擾正常神經(jīng)元，進(jìn)而造成神經(jīng)損傷〔4，5〕。本研究以AGEs/RAGE為靶點(diǎn)，研究當(dāng)歸四逆湯抑制DPN作用機(jī)制，為臨床上DPN防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立 雄性Wistar大鼠40只，體重(240±20)g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(吉)2016-0003。大鼠隨機(jī)分籠飼養(yǎng)于無特殊病原菌(SPF)條件下。喂養(yǎng)1 w、禁食12 h，于左下腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ，50 mg/kg)，72 h后尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L的大鼠為造模。

1.2分組及給藥 造模3 d后將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組、西藥組，每組10只。另取10只健康大鼠設(shè)為正常組。模型組、正常組大鼠給予生理鹽水灌胃；中藥組大鼠給予熬制的當(dāng)歸四逆湯(7.44 g·kg-1·d-1)灌胃，西藥組給予氨基胍100 mg·kg-1·d-1灌胃，共干預(yù)8 w。每天稱量體重及監(jiān)測(cè)血糖。

1.3取材及檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1檢測(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度 給藥8 w后，各組大鼠腹腔注射20%烏拉坦(5 ml/kg)麻醉，俯臥固定分離坐骨神經(jīng)。檢測(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度：利用Medlab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)測(cè)定坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(MCV)和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(SCV)。刺激點(diǎn)位于坐骨結(jié)下，記錄電極位于離刺激點(diǎn)2 cm處，刺激量從較小開始，逐漸增強(qiáng)到超強(qiáng)刺激。神經(jīng)傳導(dǎo)速度以復(fù)合動(dòng)作電位出現(xiàn)的潛伏期與復(fù)合動(dòng)作電位傳導(dǎo)的距離比值來表示。

1.3.2檢測(cè)坐骨神經(jīng)形態(tài)變化 給藥8 w后，分離大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，檢測(cè)坐骨神經(jīng)形態(tài)變化。病理形態(tài)檢測(cè)：坐骨神經(jīng)放入10%甲醛溶液中固定，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4 μm，HE染色，進(jìn)行光鏡下病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.3.3分光光度法檢測(cè)坐骨神經(jīng)AGEs含量 將坐骨神經(jīng)超聲勻漿，勻漿液4℃放置40 min，低溫10 000 r/min離心15 min，取沉淀用于測(cè)AGEs含量。

1.3.4熒光定量PCR法檢測(cè)RAGE mRNA的表達(dá) 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用表1中的引物擴(kuò)增Glo1、RAGE，以GADPH做內(nèi)參，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物。利用2-△△CT值比較各目的基因的mRNA表達(dá)情況。△△CT=(△CT實(shí)驗(yàn)組-△CT對(duì)照組)，其中△CT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)。內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。

表1 PCR引物

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件，組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1當(dāng)歸四逆湯對(duì)各組體重和血糖的影響 給藥8 w后，與正常組相比，其余各組體重明顯減輕(P<0.01)，血糖均明顯升高(P<0.01)；與模型組及西藥組相比，中藥組體重增加、血糖明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組體重及血糖水平比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組及西藥組比較：2)P<0.05

2.2當(dāng)歸四逆湯對(duì)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響 給藥8 w后，與模型組相比，各組坐骨神經(jīng)MCV和SCV都明顯升高(P<0.01)，說明當(dāng)歸四逆湯和彌可保都能提高糖尿病大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度。西藥組的神經(jīng)傳導(dǎo)速度與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而中藥組與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明雖然當(dāng)歸四逆湯與彌可保都能提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度，但是當(dāng)歸四逆湯的效果更好，神經(jīng)傳導(dǎo)速度接近于正常水平。見表3。

表3 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度

與模型組比較：1)P<0.01；與正常組比較：2)P<0.05

2.3當(dāng)歸四逆湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)病理形態(tài)的影響 給藥8 w后，正常組坐骨神經(jīng)縱切表現(xiàn)為有髓神經(jīng)纖維排列緊密，髓鞘組織正常，雪旺細(xì)胞散在髓鞘邊緣；橫切髓鞘內(nèi)軸突清晰可見。模型組坐骨神經(jīng)縱切表現(xiàn)為神經(jīng)纖維腫脹，鞘細(xì)胞減少；橫切表現(xiàn)為神經(jīng)外膜毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分軸突消失。西藥組坐骨神經(jīng)出現(xiàn)部分神經(jīng)纖維腫脹，鞘細(xì)胞數(shù)目減少，大部分髓鞘溶解。中藥組坐骨神經(jīng)中可見到少數(shù)正常髓鞘，鞘細(xì)胞數(shù)目增多，髓鞘中可見正常軸突。說明當(dāng)歸四逆湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)具有明顯保護(hù)作用。見圖1。

圖1 各組坐骨神經(jīng)病理形態(tài)(×40，HE)

2.4當(dāng)歸四逆湯對(duì)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中AGEs水平的影響 給藥8 w后，模型組的AGEs含量(173.42±14.87)明顯高于正常組(70.21±9.26，P<0.01)；中藥組與模型組相比，坐骨神經(jīng)中的AGEs水平明顯降低(124.65±14.16，P<0.05)。說明當(dāng)歸四逆湯能降低糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)內(nèi)AGEs含量。

2.5當(dāng)歸四逆湯對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)中RAGE mRNA水平影響 給藥8 w后，與正常組(10.21±1.62)相比，模型組大鼠坐骨神經(jīng)中的RAGE水平(30.36±1.87)明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，中藥組坐骨神經(jīng)中RAGE表達(dá)明顯降低(15.56±2.61，P<0.05)，見圖2。說明當(dāng)歸四逆湯能降低RAGE mRNA表達(dá)。

圖2 各組坐骨神經(jīng)內(nèi)RAGE mRNA的表達(dá)水平

3 討 論

盡管DPN發(fā)病機(jī)制還有待探討，但已明確糖尿病時(shí)過高血糖產(chǎn)生的AGEs與RAGE結(jié)合啟動(dòng)的下游信號(hào)通路起著關(guān)鍵作用〔6〕。因此，降低AGEs及RAGE含量，將會(huì)切斷后續(xù)的通路進(jìn)而抑制DPN。

本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸四逆湯能提高糖尿病大鼠的坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，改善坐骨神經(jīng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，說明當(dāng)歸四逆湯能對(duì)DPN具有明顯的抑制作用。此外，糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)中AGEs和RAGE含量明顯升高，應(yīng)用當(dāng)歸四逆湯后坐骨神經(jīng)內(nèi)AGEs含量明顯降低，其受體RAGE mRNA的表達(dá)也明顯下調(diào)，說明當(dāng)歸四逆湯減少了AGEs的生成和RAGE的表達(dá)。 因此，當(dāng)歸四逆湯對(duì)DPN的抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)AGEs/RAGE軸實(shí)現(xiàn)的，這不僅闡釋了當(dāng)歸四逆湯治療DPN的機(jī)制，也為DPN的進(jìn)一步防治提供了新思路。