白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素和大黃素對2BS細胞生長增殖能力的影響

王培昌 張雁冰

(首都醫科大學宣武醫院檢驗科，北京 100053)

復制性衰老又稱細胞衰老，是指體外培養的細胞只能進行有限次數的分裂〔1〕。復制性衰老是生物整體衰老的基礎，鑒于在生物整體水平上衰老研究標準化瓶頸，復制性衰老研究可作為衰老研究的主要手段。衰老的自由基(FR)學說認為，FR水平隨齡累積，通過脂質過氧化及對生物大分子的損傷而致細胞衰老〔2〕。前期研究發現，抗氧化劑L-肌肽、氨基胍可有效滅活FR，并可延緩細胞衰老〔3,4〕。白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素、大黃素富含于葡萄、大豆、生姜、大蒜等水果或食物中，且具有較強的抗氧化活性〔5～8〕，其對細胞衰老如何影響？本文以人胚肺二倍體成纖維細胞(2BS)為模型，觀察上述抗氧化劑對細胞體外傳代次數(PDs)、細胞生長增殖能力、細胞表型及DNA損傷修復能力的影響。

1 材料與方法

1.1抗氧化劑 白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素和大黃素皆為分析純(西安天行健天然生物制品有限公司，西安)，由二甲基亞砜(DMSO)溶解，儲存液濃度為1 mmol/L，再由DMEM培養液稀釋至所需濃度，同體積的DMSO加入DMEM作為對照。

1.2細胞 2BS(北京天壇生物制品股份有限公司，北京)細胞形態及細胞學特征均無異常，體外培養代齡平均為55～60代，30代以下為年輕細胞，55代及以上為衰老細胞。

1.3主要儀器 酶標儀(Bio-TEK，Rockville，MA，USA)，普通光學顯微鏡(Olympus)，ImageMaster VDS成像系統(Pharmacia Biosci Inc，Sweden)。

1.4細胞培養〔4〕使用含有10%胎牛血清(Logan，UT，USA)的DMEM培養基(Gibco，BRL)，在飽和濕度、37℃、5%CO2通用培養條件下培養。當細胞融合度85%～90%時，按1∶2或1∶4傳代。普通DMEM培養基培養20 h，待細胞全部貼壁后，轉入含藥培養基繼續培養，對照組2BS培養基加入同體積DMSO。

1.5藥物對細胞毒性的觀察 融合狀態的2BS細胞(28代)，傳代并接種于無菌6孔板或24孔板，普通DMEM培養20 h，轉入含不同濃度藥物的DMEM繼續培養3 d，普通光學顯微鏡下觀察細胞生長狀態、細胞排列及融合狀況、胞體是否收縮或裂解、細胞碎片及中毒顆粒的多少等，各抗氧化劑濃度梯度設為1、10、50、100、200、500、1 000 μmol/L。

1.6抗氧化劑對細胞增殖能力的影響〔4〕將2BS細胞接種于96孔細胞培養板，每孔細胞數2.5×103個，每孔體積200 μl。普通DMEM培養基于37℃、5%CO2條件下培養20 h，換含藥DMEM培養基并于上述條件下繼續培養72 h，每孔加25 μl四甲基偶氮唑鹽(MTT，10 mg/ml)，37℃、5%CO2條件下培養4 h，小心吸凈孔內液體，每孔加0.2 ml DMSO，使結晶物充分溶解，以DMSO作空白，于10 min內測定每孔在490 nm處的吸光值。每點設6個平行樣孔。

1.7抗氧化劑對2BS細胞DNA損傷的影響 將30代齡2BS細胞，以不同濃度的含藥DMEM培養基培養4 h(藥物濃度梯度為10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L)，收集細胞，以下述程序行彗星試驗〔4〕：取110 μl 0.5%的正常熔點瓊脂糖(NMA)鋪于預冷的磨毛玻片上，用蓋玻片壓平膠面，4℃凝固15 min，移去蓋玻片，于37℃水浴中將100 μl 1%低熔點瓊脂糖(LMA)與等體積的細胞懸液混勻，細胞密度約為1×106個/ml，取75 μl鋪于第一層膠上，迅速蓋上蓋玻片，4℃凝固15 min，去掉蓋玻片。將膠板浸于預冷的細胞裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L Na2EDTA，1%十二烷基肌氨酸鈉，10 mmol/L Tris，pH 10，1%Triton X-100)中，4℃避光裂解1 h，取出膠板，放于水平電泳槽中，加入新配制的電泳緩沖液(0.3 mmol/L NaOH，1 mmol/L Na2EDTA，pH 13)，4℃、避光靜置10 min，4℃、15 V(1 V/cm，200 mA)電泳25 min。將膠板移置一潔凈平皿中，中和液(0.4 mol/L Tris-Cl，pH7.5)中和兩次，然后以5 μg/ml的PI避光染色20 min，置于熒光顯微鏡(TCS.SPZ，Leica，Manheim，Germany)下觀察，攝取圖象。綠光激發，激發波長567 nm，阻擋波長590 nm。

1.8統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1四種抗氧化劑對2BS細胞體外PDs的影響 各含藥培養基(抗氧化劑濃度均為1 μmol/L)培養的細胞體外PDs均較對照組細胞有所下降，以姜黃素〔(46.0±3.2)代〕、大黃素〔(41.0±2.9)代〕培養基培養的細胞PDs下降最為顯著(P<0.05)，提示上述抗氧化劑可能存在一定的細胞毒性。白藜蘆醇〔(50.0±2.9)代〕、染料木黃酮〔(52.0±3.0)代〕與對照組〔(54.2±3.4)代〕無統計學差異(P>0.05)。

2.2四種抗氧化劑對2BS細胞生長增殖能力的影響 圖1是不同濃度的藥物培養基培養2BS細胞72 h后在490 nm處光吸收變化，結果顯示白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素均在低濃度下促進細胞生長增殖，促進細胞生長增殖的最佳濃度分別是1.0 μmol/L、1.0～5.0 μmol/L、1.0 μmol/L。大黃素對2BS細胞生長增殖的促進作用不顯著。隨著濃度升高，四種抗氧化劑對細胞生長增殖能力的促進作用逐步下降，并在高濃度下表現出對細胞生長增殖的抑制作用。

圖1 四種抗氧化劑對2BS細胞生長增殖能力的影響

2.3四種抗氧化劑對2BS細胞表型的影響 以1、10、50、100、200、500 μmol/L、1 mmol/L濃度的藥物培養基培養28代齡2BS細胞3 d，細胞形態見圖2。結果顯示，隨著抗氧化劑濃度升高，細胞胞體逐漸收縮、折光性逐漸下降，細胞融合速度減緩等，200 μmol/L白藜蘆醇、500 μmol/L染料木黃酮、50 μmol/L姜黃素、10 μmol/L大黃素培養的細胞既可在顯微鏡下觀察到細胞表型、融合速度的變化。

圖2 四種抗氧化劑培養基培養28代齡2BS細胞3 d后的細胞形態及融合狀況(×100)

2.4四種抗氧化劑對2BS細胞DNA損傷的影響 將30代齡2BS細胞，以不同濃度的含藥DMEM培養基培養4 h(藥物濃度梯度為10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L)，彗星實驗結果見圖3。結果顯示，隨著抗氧化劑濃度升高，彗尾長度逐漸增加，尤以姜黃素、大黃素最為明顯，說明上述四種抗氧化劑在高濃度下均對DNA有一定的損傷作用。

圖3 四種抗氧化劑培養基培養30代齡2BS細胞4 h彗星試驗結果(×100)

3 討 論

FR隨齡累積，并通過脂質過氧化損傷細胞膜磷脂雙分子層、DNA單鏈斷裂或基因突變影響基因表達、染色體端粒縮短速度加快等加速細胞衰老〔2，9，10〕。前期研究發現，有效滅活FR可延緩細胞衰老〔3，4〕。白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素、大黃素富含于葡萄、大豆、生姜、大蒜等水果或食物中，且具有較強的抗氧化活性〔5～8〕，那么，上述抗氧化劑能否有效地延緩細胞衰老呢？本研究發現上述藥物培養基培養的細胞PDs均低于對照組細胞，尤以大黃素培養的細胞傳代次數最少，推測上述四種抗氧化劑可能同時存在延緩細胞衰老及抑制細胞衰老的雙重效果。

細胞生長增殖能力是細胞衰老的主要生物學指標之一，本研究發現，白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素均在低濃度時顯示了較好的促進細胞生長增殖效果，然而，隨著濃度升高其對細胞生長增殖能力的促進作用逐步下降，并在高濃度下表現出對細胞生長增殖的抑制作用，而大黃素即使在低劑量條件下亦未顯示對細胞生長增殖的促進作用。為驗證上述結論，本研究以不同濃度的上述抗氧化劑培養細胞，發現低劑量時細胞生長狀態良好、細胞融合速度優于對照組細胞，隨著抗氧化劑濃度升高，細胞胞體逐漸收縮、折光性逐漸下降，細胞融合速度減緩等，從而驗證了上述結論。提示上述抗氧化劑存在促進細胞生長和細胞毒性雙重作用，且隨劑量加大其雙重作用均加大，低劑量抗氧化劑連續培養細胞時，細胞毒性隨培養時間延長而累積，從而抵消了其對細胞生長增殖能力的促進效果。上述抗氧化劑細胞毒性的機制如何呢？本研究以不同濃度的抗氧化劑培養細胞，而后行彗星試驗，發現隨著抗氧化劑濃度的加大，彗尾長度逐漸加大、說明上述抗氧化劑可斷裂單鏈DNA，且隨著劑量加大其損傷作用愈強，提示上述四種抗氧化劑的細胞毒性基于其對細胞DNA損傷作用。

白藜蘆醇、染料木黃酮、姜黃素、大黃素在低濃度時可促進細胞生長增殖，但存在基于損傷DNA的細胞毒性；上述四種抗氧化劑不能延緩細胞衰老，歸因于其促進細胞增殖和細胞毒性的雙重生物學作用。