基于SPME技術的水產品風味化學研究進展

李博恩，仇玉潔，李曉月，賀 江，楊品紅

（湖南文理學院生命與環境科學學院/環洞庭湖水產健康養殖與加工湖南省重點實驗室/湖南省水產高效健康生產協同創新中心，湖南常德415000）

0 引言

中國水產資源豐富，水產品產量逐年增加。據全國漁業經濟統計公報顯示，2016年全國水產品總產量6901.25萬t，比上年增長3.01%；全國水產品人均占有量49.91 kg，比上年增加1.17 kg，增長2.4%。這反映出近年來國民對于水產品的消費需求呈現出明顯上升趨勢。水產品中含有高質量的蛋白質，是人類滿足蛋白質需求的良好資源。同時有關研究表明，魚肉中還富含鐵、鋅、硒等微量元素以及牛磺酸、類胡蘿卜素、甾醇等生物活性物質[1]，對于人體的生長發育具有積極作用。但是由于水產品或水產制品中存在獨特的風味，包括令人愉快的和令人不愉快的，因此從食品感官角度看，會影響消費者的消費心理。為了降低對消費者的負面影響，同時更好地開發和利用水產品中的風味物質成分，指導水產制品生產，改進加工工藝[2]，近年來國內外學者對于水產品中風味的來源、組成成分進行了深入研究。

風味化學是研究食物風味的形成、風味物質的化學組成、風味物質的變化規律以及呈味物質的人工制造和風味食品的工業化生產等領域的一門學科。水產品的風味主要由揮發性風味物質和非揮發性滋味物質組成[3]，其中前者是決定水產品風味的重要因素，研究其組成成分和含量具有重要意義，可以提升水產品的質量評價[4]。水產品風味不是由單一物質作用產生，而是多種不同組分在數量上細微平衡的結果[3]，具有組分種類多、含量極微、穩定性差[5]等特點。因此，提取方法對于分析結果可靠性和準確性的影響較為明顯，選擇和使用合適的提取方法，對于其研究結果十分關鍵。SPME技術是一種新型的樣品前處理技術，集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體[6]。與其他常用的風味物質提取技術相比，該技術克服了傳統樣品前處理技術的缺陷，提取簡便、快速，受到了研究學者的歡迎。筆者總結了近年來SPME技術在一些水產品風味物質提取上的應用，以期為有意深入了解此技術并應用于水產品風味物質研究的讀者提供參考。

1 SPME技術的基本原理

固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)技術是Waterloo大學的Belardi等[7]開發出來的一種新型的樣品前處理方法，是一種基于吸附劑萃取技術發展而來的，能在萃取的同時對分析物進行濃縮的操作技術，有直接、頂空和膜保護3種[9-10]萃取方式。該技術采用涂有固定相的熔融石英纖維來吸附、富集樣品中的待測物質，具有操作簡單、樣品用量少、靈敏度高[8]等特點。隨著科學技術的發展，SPME技術不斷改進，經歷了纖維針式固相微萃取(fibre SPME)、管內固相微萃取(in-tube SPME)[11]、攪拌棒式固相微萃取(stir bar sorption extraction，BSE)[12]幾個階段，富集倍數和萃取效率不斷提高[13]。其操作流程分為萃取和分析2個部分（圖1）：具有吸附涂層的萃取纖維暴露在樣品中，在適當的外界條件下進行萃取，將揮發性風味物質成分富集在萃取頭上；將已完成萃取過程的萃取針頭插入精密分析儀器，如氣相色譜進樣裝置的氣化室內，使萃取纖維上的萃取物不斷被載氣吹過而解吸，進入后序的儀器進行分析。

圖1 SPME方法的建立

SPME方法屬于動態平衡萃取、非完全萃取，應用更加廣泛。與一些傳統的提取技術相比，SPME的優點較為顯著。首先，SPME方法不需要溶劑，操作簡單、高效、靈敏，成本低[13]。在過去一段時間里，固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)也是一種常用的將待測物質與樣品基質分離并進行凈化和富集的樣品前處理技術，但與SPME相比，SPE的缺點在于溶劑的選擇較為麻煩，除了要將待測物全部萃取出來，還要考慮其與填料層和樣品基質的匹配問題，因此溶劑的選擇過程變得極為繁瑣。況且風味化學的研究過程大多為探究成分未知的樣品組分，這又給選擇過程增加了難度，因此，SPME便成為了眾多風味化學研究者的優先選擇。其次，SPME可以與多種現代分析儀器聯用[13]，如氣相色譜、質譜儀和高壓液相色譜等，實現自動化操作。前已述及，水產品風味的關鍵在于揮發性風味物質，因此揮發性是選擇提取方式時要考慮的一個關鍵性質，所以自從20世紀60年代風味化學成為化學的一個新分支以來相當長的一段時間內，蒸餾法一直是研究者的一個傾向性選擇。Likens和Nickerson于1964年首次設計發明的同時蒸餾萃取法[14]就是其中之一，此技術通過同時加熱樣品和有機溶劑的混合體系至沸騰，使風味物質溶入有機溶劑中，以達到提取和富集試樣中揮發性、半揮發性成分的目的[2]。該方法使用萃取溶劑少，有良好的可重復性。但是該法過程耗時，可能會造成某些易揮發成分的損失，進而影響研究結果的全面性和準確性。除此之外，SPME方法萃取的量很小，不會對樣品體系的原始平衡造成影響[13]，因此對基質的消耗可以忽略。

綜上所述，鑒于其獨特的優勢，結合水產品中揮發性風味物質量小、成分復雜、需要用色譜、質譜等精密儀器綜合分析的特點，SPME已被越來越多的研究者認可，被廣泛應用于水產品風味化學的研究中。

2 SPME方法的建立

2.1 SPME萃取裝置

SPME裝置由萃取頭和手柄構成，其中萃取頭上的涂層是其核心[2]，萃取涂層的作用是實現對有機分子的萃取和富集，因此其性質要盡量與被提取物的性質匹配，從而使被提取物在涂層中有較快的擴散速度，進而能夠在較短時間內達到分配平衡。其次，由于SPME裝置可以與一些大型儀器聯用實現自動化操作，所以萃取物一般都要在高溫條件下解吸，這就要求涂層能夠使萃取物在熱解吸時迅速脫離，不會造成峰的擴寬[15]，正是這些技術要求的存在，促進了SPME萃取涂層的研發和改進。目前，涂層材料已經實現了商業化生產，不同種類的材料用于吸附不同性質的揮發性物質。與此同時，為了使SPME操作更加方便，以便助力此技術的推廣，國內外許多學者對于SPME裝置手柄部分也進行了大量的改進工作。

2.2 SPME的萃取條件

SPME的萃取過程是一個非常復雜的傳質過程，除了萃取頭的選擇，實驗條件也會影響萃取結果。如萃取溫度對萃取的影響具有雙重效應。在一定范圍內升高溫度，可以使提取物在基質中的擴散速度加快，達到平衡的時間縮短，可以減小潛在的損失以及富集物自身結構破壞的可能性；升高溫度過多時會導致分析物在涂層中的分配系數降低，造成對分析物吸附量減小，從而影響SPME裝置的靈敏度[16]。萃取時間也會受到待分析物的分配系數、物質的擴散速率等多因素影響[17]，影響富集物在涂層中的平衡，從而給分析結果增加了不確定性。除此之外，解吸時間、無機鹽添加量等條件也會對萃取過程產生不同程度的影響。

胡靜等[18]采用頂空固相微萃取法提取鱖魚肌肉的揮發性風味物質，通過對比實驗篩選了固相微萃取纖維頭，優化了頂空固相微萃取的操作條件。結果表明用75 μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷纖維頭優于65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯萃取纖維頭，在80℃下將鱖魚肌肉樣品頂空吸附40 min能達到最優的提取效果，然后在50℃條件下解吸5 min，而后用GC-MS對解吸物進行分離鑒定。結果共鑒別出37種揮發性成分，其中含量較高的是醛、醇、酮類化合物，據分析出的揮發性成分的風味特征可知對鱖魚肌肉揮發性風味貢獻較大的物質有己醛、庚醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、2,5-辛二酮等。翁麗萍等[19]以養殖大黃魚為研究對象，對其主要揮發性風味物質的SPME-GC-MS分析條件進行優化，分組探究了不同的萃取頭、萃取條件、分析條件等對SPME萃取結果的影響，而后將各組的實驗結果整合。結果顯示，采用DVB/CAR/PDMS涂層材料的SPME萃取頭提取養殖大黃魚的富集物，經分析后結果最為全面。此外，還探究了萃取的最適溫度、合理的萃取時間等實驗條件。

2.3 SPME的分析條件

SPME可以與多種現代分析儀器聯用，實現自動化操作。從近些年從事風味化學研究的學者所報道的資料看，采用SPME技術與自動化分析儀器聯用的實驗方法占了很大比例。這些分析儀器主要有氣-質聯用儀、UPLC、電子鼻等。江健等[20]用65μm DVBPDMS的萃取頭，采用頂空的方式萃取鰱、鳙、鯽、草魚肉的樣品，萃取溫度50℃，萃取時間為30 min。然后將萃取樣品加入到氣相色譜儀中進行分析獲得總離子峰圖，結果非常清晰，將其與NIST質譜數據庫檢索和文獻對照，分別檢出4個樣品中揮發性風味成分為40、42、42和31種，對其風味有較大貢獻的主要是揮發性羰基化合物和醇類，同時含有少量的酯類和硫醚類化合物。陳俊卿等[21]以白鰱魚為原料，采用涂有聚二甲基硅氧烷-二乙烯苯涂層的SPME萃取頭，以魚肉氣味成分中含量比較多的己醛、己醇、庚醛、庚醇、辛醛、1-辛烯-3-醇、壬醛等為參照對象，比較了不同涂層的萃取頭、萃取時間、萃取溫度、解吸時間、程序升溫速率等因素對固相微萃取的萃取效率的影響，建立了頂空固相微萃取技術與氣-質聯用儀聯合分析鑒定魚肉中風味物質的方法。結果表明，SPME裝置有效地吸附了白鰱魚中的揮發性成分，經NIST質譜數據庫檢索和文獻對照，共確定27種物質。萃取過程簡單、快速，不會對環境造成污染，為研究者帶來了極大便利。施文正[22]用SPME結合電子鼻和氣-質聯用儀對養殖草魚肉中的不同部位揮發性成分進行了對比研究，同時探究季節和魚齡對養殖草魚肉揮發性成分的影響，采用主成分分析對電子鼻數據進行分析，利用養殖草魚不同部位對傳感器響應值生成雷達和柱狀圖，用Xcalibur軟件系統處理GC-MS數據生成總離子峰圖，通過NIST和Wiley譜庫確認定性，取得了非常好的成果。

3 SPME在水產品風味物質提取中的應用

3.1 水產品主要風味物質成分研究概述

風味物質影響著消費者對水產品的嗅覺感受，因此研究其組成成分及貯藏、運輸過程中組成成分的變化對于水產品的銷售具有重要意義。但天然混合體系中風味物質組分具有一定的復雜性和未知性，所以要實現盡可能完全的提取存在一定的難度，而SPME方法則可以在一定程度上減小由于這些困難對提取過程產生的影響。在SPME方法建立過程中，分析物在萃取涂層與樣品基體中的分配系數較大，而樣品本身體積很小，所以該分析物幾乎可以代表樣品中的各組分，這樣的特點尤其適用于因樣品量太小而不能直接進行分析的樣品[23]，因此受到學者的廣泛青睞。

中國的水產品市場龐大、種類豐富，有魚、蝦、蟹、貝4類，為消費者提供了多元化的選擇，除魚類外，研究和開發其他水產品的風味物質資源也具有十分重要的意義。解萬翠等[24]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜對蝦頭中的揮發性化合物進行分離與鑒定，選擇C5～C20正構烷烴標準品，實現了對蝦頭中62種揮發性化合物的定性及半定量分析，取得了令人滿意的成就。經RI值驗證后得出結論，蝦頭風味物質中主要有烴類18種、酮類14種、醛類8種、醇類6種、脂類5種，還有一些雜環化合物及少量未知物。其中部分醇類和酮類化合物對蝦頭特征風味貢獻較大。

20世紀90年代以來，外國學者對一些品種海水蟹的揮發性風味成分做了一定的研究報道[25-29]，鑒定其風味物質的組成成分。而他們研究時主要采取的提取方法是前已述及的同時蒸餾萃取法。但該法有提取溫度較高、提取時間長的特點，因此提取過程極易造成某些易揮發性風味成分的流失甚至破壞，從而導致螃蟹整體風味發生變化[30]，影響實驗結果的準確性。顧賽麟等[31]采用頂空的方式，用75 μm CAR/PDMS萃取頭，在沸水浴下吸附50 min，然后用GC-MS方法共鑒定得到6大類77種化合物。對其中主要的揮發物含量、氣味特征及其來源進行分析，根據所檢出的物質種類推測出揮發性風味物質來源及其產生途徑，如醇類可能是由于脂肪酸的二級氫過氧化物分解產生，結果較為合理。

貝類產品具有高蛋白、高微量元素和少脂肪等優點，其中素有“海底牛奶”美稱的牡蠣肉更是以其味道鮮美、營養豐富、可提高機體免疫力而受到消費者的青睞。研究其體內揮發性風味物質對于進一步開發其加工制品、發揮其營養功能有重要意義。劉輝等[32]選取涂有聚二甲基硅氧烷-二乙烯苯涂層的SPME萃取頭，萃取溫度為60℃，萃取時間為30 min，采用直接萃取的方式提取牡蠣肌肉中的風味物質，而后通過氣-質聯用儀來分析鑒定牡蠣肌肉中的風味物質，經過NIST質譜數據庫和文獻對照，確定24種物質，其中葉綠醇、肉豆蔻酸、鄰苯二甲酸二丁酯等化合物含量比較豐富，對于其獨有的風味有較大貢獻。實驗提取效果較好，分析結果詳細。郝帥[33]采取頂空的方式，將離心處理后的上清液置于頂空瓶中，在PAL自動進樣器上以60℃預熱20 min，而后采用二乙烯基苯/carboxen/聚二甲基硅氧烷固相微萃取纖維萃取，萃取后自動進樣器將纖維轉移至GC進樣口進行分析，將結果繪制成以提取質量為橫坐標，所檢測到的峰面積與內標物的比值為縱坐標的各化合物的標準曲線，結果清晰明了。

3.2 水產品加工過程中風味物質的變化

中國從事水產捕撈歷史悠久，捕撈經驗豐富，但由于傳統捕撈漁業已達到最大產量水平，發展水產養殖已成為填補水產品供應缺口的重要途徑。改革開放以來，水產養殖業得到了快速發展。隨著水產品養殖量的不斷提高，人們的消費要求提高，除一部分就地鮮銷外，很多水產加工業者都通過對水產品進行不同程度的加工來實現長期保藏或者制造成各類用途更廣、價值更高的加工食品，以實現水產品營養價值利用的最大化。水產品加工方向有2種。一是以可食用部分制成腌熏制品、魚糜制品等的食品加工業，二是以食用價值較低或不能食用的水產動物以及水產加工的廢棄物等為原料，加工成魚粉、魚油等的非食品加工業[34]。但不論哪一種加工方式，都是以提高水產品的利用價值為目的，是延續漁業發展的重要方向。而研究加工過程中風味物質成分及其變化，可作為改進加工工藝時可利用的營養來源，也可以在某種程度上作為評價加工工藝合理性的參考指標。

楊立平等[35]利用頂空固相微萃取提取秘魯魷魚絲加工過程中5個關鍵控制點的風味物質成分，通過分析其物質組分作為其品質變化指標。經過提取后以電子鼻和氣-質聯用儀分析共鑒定出119種揮發性物質，其中各關鍵控制點肉中分別是23、31、45、61、35 種，包括碳氫類、酯類、酮類、醛類、雜環類化合物等，結果表明，焙烤溫度增加有利于形成更為豐富的風味[35]，通過SPME裝置提取，他還探究了其他工藝條件對風味的影響，提取效果顯著，檢測結果較為全面，為改進秘魯魷魚絲加工工藝和提高魷魚絲品質提供了理論依據。貢慧等[36]以秋刀魚為研究對象，用固相微萃取-氣質聯用法分別提取和分析熱加工前后秋刀魚的揮發性物質，探究熱加工對其風味物質成分的影響。結果在生鮮秋刀魚中提取出27種揮發性風味物質，而115℃熱加工后的秋刀魚風味物質發生了明顯改變。經分析，提取出的物質種類達到48種，主要包括醛類、醇類、酮類和雜環類化合物。而后結合電子鼻和感官評價的方法分析證實：酮類腥味物質種類和相對含量減少，油脂味、肉香味、烤肉香氣等怡人風味物質含量增加；不同熱加工溫度對秋刀魚風味物質構成產生不同影響，可參考性較高，為秋刀魚產品熱加工溫度選擇與優化提供參考。

腌干帶魚是中國傳統的水產加工食品，主要是利用魚肉自身攜帶的微生物在自然條件下進行發酵，而揮發風味是評價發酵制品品質優劣的重要指標之一[37]。吳燕燕等[37]采用頂空固相微萃取-氣質聯用技術對不同工藝腌制干帶魚的風味物質進行定性定量分析。在新鮮帶魚、傳統腌干帶魚和發酵腌干帶魚中分別檢測出27、45、56種揮發性物質，提取效果較好。分析證明醛類、醇類和酮類是構成腌干帶魚風味差異的主要化合物，其中魚肉的特征風味物質包括己醛、苯甲醛、辛醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、己醇、3-甲基丁醇、3-羥基-2-丁酮和三甲胺等。吳燕燕等[38]為了研究不同腌制方法對魚肉風味的影響，用固相微萃取-氣質譜聯用法分析測定比較了以鮮紅牙?為原料，分別采用低鹽乳酸菌法和傳統法腌制的風味成分變化，結果顯示醇、醛、酮類化合物是構成腌制干魚肉獨特風味的主要成分，經低鹽乳酸菌法腌制的干魚肉，對風味貢獻較大的揮發性化合物總量達35種，而鮮魚和傳統法腌制干魚肉中分別只有17和21種，為腌干魚制品加工技術的選擇和優化提供了理論依據。

遲明旭等[39]采用SPME方法提取用不同菌種發酵、傳統發酵和原裝市售魚肉香腸中的揮發性風味成分，經NIST08.L質譜數據庫檢索對照，各檢出26、22、17種影響風味的物質，檢出影響魚肉香腸風味的主要成分有醛酮類、醇類、酸類、酯類、烷烴類及其他化合物，并確定乙酸、己醛、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯等是魚肉香腸的特征香氣成分。晁岱秀等[40]用感官分析和頂空固相微萃取-氣質聯用法對不同魚樣品經雙酶處理制備的酶解魚露風味進行了比較，結果表明，與鮮魚酶解魚露相比，鹽漬魚雖然降低了蛋白酶的酶解效果，但酶解魚露風味較好，更接近傳統魚露的風味。鹽漬魚中沒有檢測出表現魚露特征香味的揮發性風味物質，說明需要通過進一步發酵才能更接近傳統成熟魚露的風味。付娜[41]以草魚魚丸的制作過程為研究對象，選取新鮮草魚魚糜和熟制草魚魚糜作為樣品探究漂洗次數、加熱溫度、食鹽添加對魚肉風味物質的影響，通過頂空固相微萃取方法提取后用氣質聯用儀分析，經NIST圖庫檢測以及文獻參考確認其風味物質組分的變化，明確了草魚魚糜在加工成魚丸的過程中，重要工藝步驟對其揮發性風味物質的影響，揭示了草魚魚丸加工過程中揮發性風味物質的變化規律，為提高魚糜制品品質提供了理論指導。

4 展望

隨著SPME技術的優點被越來越多的研究學者接受，其應用領域也不斷擴展，新的問題和要求也不斷出現。縱觀諸多學者的實驗設計，鮮有探究不同攪拌速率對于萃取過程影響的討論，而攪拌在萃取過程中對樣品達到分配平衡很可能產生影響，因此筆者認為可加設此條件，對萃取條件再進行優化。而在設備方面，目前有國外的科技公司如美國康寧公司生產的SPME專用的磁力攪拌器，用以配合萃取過程，而國內的產品則不是很多。再有，從生物學角度來看，部分水產生物代謝途徑已較為清楚，如有的學者就提到了一些水產生物產生風味物質的生理過程，那么可以考慮從這個角度，將萃取頭的分類進一步細化，以某些化學性質如官能團作為吸附依據，研發更具有特異性的萃取頭。分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymers，IPs)涂層具有機械強度較高、耐高溫和耐溶劑性好等特點，尤其是具有高效選擇特異性[42]，近年來受到研究學者的青睞，可作為今后的研究中新型涂層的開發和改進的方向。除此之外，未來可以將SPME與其他更多的分析技術結合，進一步提高分析的準確性，使水產加工企業更加詳細地了解水產品中風味物質組成，從而能夠充分利用水產資源，進行更加有利于人體健康的精深加工，這具有十分重要的現實意義。