優(yōu)化ApoB抗原免疫劑量提高抗體產(chǎn)生的效果

徐志偉，徐一然，陳永霞，劉偉忠，徐小波，于建寧

（1江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所，江蘇句容212400；2江蘇大學土木工程與力學學院，江蘇鎮(zhèn)江212000；3江蘇省句容市動物疫病預防控制中心，江蘇句容212400；4江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧所，南京210014）

0 引言

載脂蛋白(Apolipoprotein,Apo)是來源于血漿脂蛋白中的蛋白[1]，具有穩(wěn)定脂蛋白的功能，并通過修飾與脂代謝有關的酶活性影響脂肪代謝[2-4]。ApoB與膽固醇共同組成低密度脂蛋白(LDL)，能夠識別LDL受體，參與LDL代謝過程[5-8]，所以ApoB對保持體內(nèi)恒定的血脂水平和介導體內(nèi)脂類代謝必不可少?；诖耍薃poB的檢測在急性冠狀動脈綜合癥、糖尿病等心血管疾病的診斷及后期臨床治療等方面具有重要應用價值[9-10]。測定ApoB能夠直接反映低密度脂蛋白的水平，它與Apoa1的比值是動脈粥樣硬化等心血管疾病預測和診斷的重要指標。

在動物生物技術中，免疫血清制備是一項常用的技術。通過制備高效價、高特異性的免疫血清可以為免疫學診斷提供試劑，亦可用于醫(yī)學上特異性免疫治療或者相關醫(yī)療研究。免疫血清的制備也是科研院所免疫學實驗的重要內(nèi)容，是免疫學實驗室必不可少的生物制劑。然而目前通過免疫大動物獲得免疫血清中的抗體效價并不理想，如何提高抗體效價，是拓寬免疫血清應用的主要限制因素之一。本試驗研究通過免疫湖羊不同劑量的ApoB抗原，分析湖羊生產(chǎn)羊抗人血清的效果，通過抗體效價、抗體產(chǎn)生規(guī)律和ApoB產(chǎn)品性能檢測，獲得最佳抗原注射量，為規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎，同時為增加傳統(tǒng)畜牧養(yǎng)殖的經(jīng)濟收益提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗羊：在句容市行香羊場選擇健康羊只，年齡10月～1.5周歲，體重40 kg左右湖羊公羊。為利于羊身體健康、試驗獲得好的效果，對實驗羊群采用放牧加舍飼的飼養(yǎng)方法，白天放牧4 h（上、下午各2 h），晚上飼喂精料一次，半個月后開始試驗。

試驗抗原：ApoB抗原購自上海元升生物科技有限公司，純度96%。

免疫佐劑：完全弗氏與不完全弗氏佐劑購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

試驗分組：將30只湖羊隨機分成3組，每組10只，打上耳標，抗原量分別為組1每次0.2 mg，組2每次0.4 mg，組3每次1.0 mg。

免疫方式：皮下多點注射，注射點分別為腹股溝3個點、肘部2個點、頜下1個點、背側(cè)2個點、耳后1個點，兩側(cè)共計16個點。

免疫程序：共計5次免疫。以組1為例，說明免疫程序。

初免：抗原1 mL(2 mg/mL)+9 mL PBS混勻后，與等量10 mL完全弗氏佐劑充分乳化后免疫羊，按16個點均勻注射。第二次免疫為間隔15天后，抗原1 mL(2 mg/mL)+9 mL PBS混勻，與等量10 mL不完全弗氏佐劑充分乳化后免疫羊，按16個點均勻注射。隨后進行3次免疫，每次間隔7天，將抗原1mL(2mg/mL)+9 mL PBS混勻后，與等量10 mL不完全弗氏佐劑充分乳化后免疫羊（按16個點均勻注射）。

組2中抗原2 mL(2 mg/mL)+8 mL PBS混勻，組3中5 mL(2 mg/mL)+5 mL PBS混勻，免疫程序與組1相同，共免疫5次，每次按16個點均勻注射。

免疫羊觀察：每天觀察羊的動態(tài)，采食情況，精神狀況，做好記錄。

抗體檢測：隨機在3個組合中各挑出5只羊，共15只羊，在免疫前、二免前、三免前、五免后5天分別采血進行ELISA抗體檢測，做好記錄。

1.3 血清制備

待血液凝固之后，在超凈工作臺中用無菌滴管把血塊剝離瓶壁，37℃放置1～2 h，放入4℃過夜，血清充分析出后經(jīng)離心沉淀分離出血清，放進低溫冰箱保存。

1.4 抗血清效價測定

抗血清效價采用常規(guī)的瓊脂擴散方法。設定標準陽性血清孔和陰性孔，主要步驟為瓊脂板的配制、打孔、補底和加樣。

1.5 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用分析軟件SPSS 17.0進行ANOVA分析，作圖SigmaPlot 10.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫羊抗體效價

血清中檢測抗體效價，結(jié)果（表1）顯示：第一次免疫后15天，即第二次免疫前，0.2 mg組抗體效價平均為在1:25.4，隨后逐漸升高到1:28.0；0.4 mg組抗體效價明顯高于其他2組，五免后的抗體效價能夠達到1:28.8；而1.0 mg組抗體效價的整體水平與0.2 mg組較為接近。但3組五免后的抗體效價均達到后續(xù)用于制備檢測試劑盒或者其他醫(yī)學用途的抗體水平。

表1 免疫后ApoB多抗血清效價比較

2.2 免疫羊抗體產(chǎn)生規(guī)律

圖1 不同免疫抗原濃度的抗體效價趨勢圖

從圖1中可以看出，隨著免疫次數(shù)的增加，血清中抗體效價逐步升高，到五免后抗體效價能夠升高到1:26～1:28；而且圖中顯示0.4 mg組從二免前一直到五免后的抗體效價都要顯著高于其他兩組，提示最佳的免疫原注射量為0.4 mg/次。注射量較少(0.2 mg)或者較多(1.0 mg)都不利于血清中抗體濃度的升高。

2.3 ApoB產(chǎn)品性能的檢測

為了后續(xù)制備試劑盒的需要，對血清中的ApoB抗體進行了產(chǎn)品性能的檢測，見表2。從外觀上看，試劑應為無色透明液體，檢驗結(jié)果符合；試劑分析的靈敏度為0.262 ΔA/(g·L)，合格；試劑空白吸光度≤0.030，符合要求；試劑的準確度亦符合要求。由此可見通過本實驗的免疫程序能夠成功生產(chǎn)出符合后續(xù)試劑盒要求的抗體。

表2 ApoB產(chǎn)品性能的檢測

3 討論

諸多研究表明，ApoB對于醫(yī)學診斷及疾病治療具有重要作用。在臨床上，檢測載脂蛋白A(ApoA)與載脂蛋白B(ApoB)對血脂的判斷具有重要意義[8-9]。由于ApoB在體內(nèi)脂類轉(zhuǎn)運、代謝以及維持血脂水平的恒定中所起的核心作用，所以ApoB的基因變異可能與動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病有必然聯(lián)系[8,11-12]。另一方面，測定脂蛋白及載脂蛋白對這些疾病發(fā)生狀態(tài)的跟蹤與分析意義重大[9,13]。但目前用于檢測ApoB的試劑盒尚不成熟。

目前抗血清的商業(yè)生產(chǎn)主要應用馬、綿羊和山羊等大型家畜，這類家畜具有壽命長、易管理、靜脈采集血液方便等優(yōu)點[10,14]。制備高效價的免疫血清的主要影響因素有抗原自身性質(zhì)、抗原的注射劑量、注射次數(shù)、間隔時間、注射途徑及抗原佐劑等[15-17]。免疫劑量的不同導致對免疫系統(tǒng)的刺激強弱存在差異，從而產(chǎn)生不同水平的抗體，進而影響免疫血清的效價[18-20]。本試驗從免疫原的注射劑量入手，對免疫劑量進行優(yōu)化，不但進一步增高了抗體的效價，而且節(jié)省了抗原用量，降低了生產(chǎn)成本。

從抗體產(chǎn)生的規(guī)律看，3種劑量的抗原都能夠產(chǎn)生ApoB抗體，生產(chǎn)趨勢一致；抗體表達量以每次0.4 mg的免疫劑量注射時最高，并非我們預猜測的免疫抗原越多越好。為了下一步做檢測試劑盒，檢測了ApoB的產(chǎn)品性能，從外觀、靈敏度、吸光度、準確度等指標進行評價，達到預期水平，可用于后期的商業(yè)化生產(chǎn)，具有較高的經(jīng)濟收益。

綜上所述，本試驗形成了一套制備ApoB抗血清的生產(chǎn)流程，從免疫的具體程序、免疫原劑量的優(yōu)化到產(chǎn)品性能的檢測，具有可重復性，可以在一定范圍內(nèi)加以推廣。