實驗室里的大腸桿菌進化實驗

吳平華

(華中科技大學附屬中學 武漢 430000)

生物進化作為事實，已經被古生物學、比較解剖學、胚胎學等生物分支學科所證實，但由于生物進化時間極其漫長，人們很難直接觀察、記錄自然界中生物進化的機理和過程，故只能通過觀察進化的現象和結果加以推測。

那么，能否在實驗室里設計出科學的進化實驗來揭示進化機理呢？1988年，美國密歇根州立大學的進化生物學家理查德·倫斯基(Richard Lenski)以大腸桿菌為實驗材料，設計了一個在實驗室里長久運行的進化實驗[1]。

1 實驗簡介

1.1 實驗選材 倫斯基以大腸桿菌為實驗對象，原因是大腸桿菌的繁殖周期短，可以極大地節省整個實驗的時間。大腸桿菌在營養充足、培養條件適宜、無天敵的理想條件下，約20min繁殖一代。在倫斯基設定的實驗條件下，大腸桿菌每天繁殖約6.6代。自1988年實驗啟動至今，其大腸桿菌已經繁殖了6萬多代。若以一年繁殖一代的生物為研究對象，則需要6萬多年才能繁殖這么多次，如果是人類則需要一百多萬年的漫長歲月。

1.2 大腸桿菌培養基 倫斯基根據實驗的需要，對細菌普通培養基的成分進行了調整： ①以微量葡萄糖作為大腸桿菌的能源物質。葡萄糖的濃度為25mg/L,僅為細菌普通培養基中葡萄糖含量的1%，目的是觀察大腸桿菌會進化出怎樣的高效代謝葡萄糖的能力。②培養基中額外添加了大量的檸檬酸鹽，其含量達到葡萄糖濃度的十多倍。加入檸檬酸鹽的目的是為了方便監測大腸桿菌在培養過程中是否被雜菌污染。因為在有氧條件下，大腸桿菌不能代謝檸檬酸鹽。若有雜菌污染，檸檬酸鹽會被分解，從而被觀測到。

1.3 實驗過程 倫斯基將單個大腸桿菌加以繁殖，然后接種于12瓶培養基中進行培養，從而形成12個遺傳基因完全相同的菌株。這12個瓶子對這些大腸桿菌來說，相當于12個完全彼此獨立的世界。大腸桿菌利用瓶中的資源進行生長、繁殖。隨著瓶中葡萄糖的逐漸消耗，大腸桿菌的生長、繁殖便逐漸減慢以至停止，24h后大腸桿菌的種群密度基本趨于一個穩定的常數值。此后的每一天，12個菌株每天每瓶被取出1%，分別接種至12瓶新的、相同的培養基中培養。每隔75d，大腸桿菌繁殖約500代，菌株樣本便被冷凍保存起來。這樣就創建了一個完備的人工“化石記錄”，使研究者能夠追溯或重演大腸桿菌的進化歷程。

實驗持續進行至今，積累的冷藏樣本已經超過4000瓶。這些樣本包括實驗開始時的菌株以及最近的菌株。

2 實驗成果

到目前為止，倫斯基團隊已經發表論文50多篇。其成果主要有：

2.1 讓人們見證了細菌新品種的誕生 大腸桿菌在繁殖約3.15萬代時，12個菌株中的一個菌株進化出了以檸檬酸鹽為食的超能力，這種突變的意義巨大。人們更感興趣的是，食檸檬酸鹽“超能力”的進化機理是什么？

倫斯基團隊用冷藏的樣本重演了進化歷程。結果顯示大腸桿菌在2萬代或更早時開始產生變異。變異再經過1.15萬代的積累,最終才進化出食檸檬酸鹽的“超能力”。

隨著基因測序技術的進步，倫斯基及時將基因測序手段引入到實驗中。目前，倫斯基團隊測定了來自12個菌株的264個完整的基因組DNA序列，通過對比分析，終于揭示了食檸檬酸鹽的進化機理[2]： 在原始菌株的基因組中，檸檬酸鹽轉運子基因(citratefermentation，簡稱citT)與相關基因citG、ma、mk呈線性排列(圖1)。

在有氧條件下citT不表達。而突變菌株的基因組中有一段2933bp的DNA片段出現了重復，使citG、citT、ma和部分的mk發生了倍增(圖2)。尤其關鍵的是：mk插在citT之前的同時，mk的啟動子取代了citT的啟動子，使citT由沉默狀態變成可表達狀態，而citT的表達產物就是運輸檸檬酸鹽的載體蛋白質——檸檬酸鹽轉運子，其功能是將檸檬酸鹽運輸到細胞內。之后的變異進一步增強了該轉運子的運輸效率，最終食檸檬酸鹽的菌株便出現了。

2.2 證實生物的進化永遠不會停滯 起初，科學家推測，只要環境因素保持穩定不變，生物就能形成一個適應狀態，當達到適應的頂峰后，生物的進化就會停止。倫斯基團隊對12個菌株的適應性都進行了檢測。檢測涵蓋了整個進化歷程的所有時間點。結果發現在繁殖約1萬代時，大腸桿菌似乎達到了適應的頂峰。然而經過多達5萬代的增殖，雖然大腸桿菌進化的速度有所減緩，但并未如人們預期的那樣停滯下來。這說明即使在一個穩定不變的環境中，生物的進化也永遠不會停滯。

2.3 證實古爾德的生物進化觀點是正確的 史蒂芬·古爾德(Stephen Jay Gould)是美國著名的古生物學家、科普作家。他在研究軟體動物進化時提出了進化是不可復制的理論： 如果再給一次進化的機會，生物的進化會朝另外的方向進行。當時，多數學者認為他的觀點是錯誤的。而倫斯基一直都對該理論持有很高的興趣。倫斯基的進化實驗顯示，12個菌株的進化具有共同的趨勢： 都進化出了更大的細胞、更快的生長速度和較低的種群密度峰值。這似乎說明進化是可復制的，但其實這是相同的環境條件導致趨同進化的結果。

例如，魚類、鯨類適應水生環境，雖然都進化形成了相同的體型、鰭、尾等，但它們的進化歷程肯定是不同的。倫斯基檢測了12個菌株的多達1.4萬個基因突變，結果顯示： 每個菌株的變異頻率都不相同，每個菌株的變異方式也不相同。例如，其中只有一個菌株產生了在有氧條件下代謝檸檬酸鹽的超能力變異,而其他11個菌株則沒有出現此種能力。

這足以證明古爾德的理論是正確性的，進化的確是不可復制的。

3 實驗爭鳴

倫斯基的進化實驗引發的爭議主要有以下兩個方面。

3.1 進化是注定的還是偶然的 12個菌株的初始基因是相同的。經歷長期的進化，最終只有1個菌株進化出代謝檸檬酸鹽的超能力，說明各個菌株進化的歷程是不相同的。即進化是偶然的而非注定的。

倫斯基選取有氧代謝檸檬酸鹽菌株的祖先進行進化史的重演實驗，結果為： 0～15000代祖先無一例成功，20000～30000代祖先有4例成功，30500～32500代祖先有13例成功。

結果表明，越是遙遠的祖先，進化成功的可能性越低，而越是年輕的祖先，進化成功的可能性越高。這說明進化出有氧代謝檸檬酸鹽的能力并非是一個單純的、幸運的突變，而是需要一定的變異累積。故進化也不完全是偶然的。

3.2 大腸桿菌的進化模式是否適用于其他物種的生物 有學者懷疑別的物種也有與大腸桿菌相似的進化模式。已經有研究者以酵母菌等進行了類似的進化實驗，但由于其工作量較倫斯基低好幾個數量級，故無法提供足夠的實驗數據對這種懷疑予以證實。

4 實驗啟示

倫斯基的實驗自1988年啟動，一直默默無聞地持續進行著，近30年的不懈努力，研究終于有所突破。倫斯基的進化實驗啟示我們： 只有拋棄急功近利的短視思維，努力地工作、默默地求索，才有可能在科研上取得些許進步和成果。