BT抗蟲蛋白研究概述

范艷艷 黃義德 周谷成 肖義軍

(福建師范大學生命科學學院 福州 350108)

蟲害是影響農作物生產的重要因素，轉基因作物研究的一個重要目的是抗蟲。目前全世界種植面積最廣的轉基因作物，是抗蟲的轉Bt基因玉米和棉花以及抗除草劑的轉基因玉米和大豆。截至2014年，全球轉基因作物種植面積高達1.815億公頃，中國的種植面積在全球排名第六，其中種植面積最廣的是轉蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis， Bt)的抗蟲蛋白基因(簡稱Bt基因)的抗蟲作物。我國1991年開始研究Bt，成功合成的第一個Bt基因是晶體蛋白基因家族(cry)的cry1A，1997年首次克隆出Bt殺蟲晶體蛋白基因。自1997年批準轉基因抗蟲棉的商業化生產以來，抗蟲棉的種植面積與應用率逐年上升。數據顯示1997—2014年間，轉Bt基因棉花帶來的經濟效益約為1200億元。目前，我國已成功克隆285個殺蟲晶體蛋白基因，超越美國位居世界第一。且2010年以來，我國發現的新型Bt基因總數占全球的50%以上，多種有明確殺蟲功能的基因已獲得專利保護。

值得關注的是，轉Bt基因玉米中表達的Bt抗蟲蛋白在使作物免受蟲害的同時，也產生了食用玉米中Bt蛋白的安全性問題，即對昆蟲有毒害作用的Bt抗蟲蛋白一旦進入人體會否引起中毒成了關注的焦點。本文概述Bt蛋白及其抗蟲機制，以及轉Bt基因作物的安全性問題。

1 Bt蛋白概況

Bt是一種革蘭氏陽性細菌，主要生活在土壤中，也可從昆蟲、植物以及水環境中分離獲得，它與其他芽胞桿菌的區別是在芽胞形成過程中伴隨有殺蟲晶體蛋白的產生。轉基因研究中所說的Bt蛋白通常是指Bt在芽孢形成過程中母細胞產生的殺蟲晶體蛋白，以及在營養生長期產生的營養期殺蟲蛋白。Bt蛋白具有良好的抗蟲性能，其優越的抗蟲性能一直被作為農藥用于農業生產中，是世界上使用最廣泛的微生物殺蟲劑。隨著生物科技的發展，將Bt基因轉入植物基因組中，制備具有抗蟲性能的轉基因作物是多年來轉基因作物研究的重要內容。

Bt母細胞形成芽胞時產生的殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)主要由細胞外溶解性晶體蛋白基因家族(cyt)和晶體蛋白基因家族(cry)編碼，cyt和cry類基因產物對鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、雙翅目等多種昆蟲以及線蟲和螨類節肢動物具有特異性殺滅作用[1]，因此廣泛用于構建轉Bt基因作物。Cry蛋白并不由Bt本身的基因組基因編碼，而是由Bt內的質粒基因編碼，不同的Bt內含有不同的cry基因，目前克隆得到并命名的殺蟲晶體蛋白基因已超過800個。不同的轉Bt基因玉米品種產生的Bt蛋白互不相同，其所對抗的蟲害也就不同。例如，目前常用的轉基因Cry1Ab蛋白主要針對歐洲玉米三化螟、西南玉米三化螟和玉米穗蟲等，對玉米根蟲就無毒性；而轉基因Cry34Ab1蛋白毒殺的是玉米根蟲，對歐洲玉米三化螟等就無毒性。因此，可通過構建含有多種Bt蛋白的轉Bt基因作物擴展抗蟲譜，提高抗蟲性能。

2 Bt蛋白的抗蟲機制

Bt抗蟲蛋白中研究較多的是Cry蛋白，其抗蟲的主要機制可由“孔洞形成”模型說明： 昆蟲攝取Cry蛋白后，在昆蟲體內強堿性的中腸段經堿性蛋白酶消化，形成小分子的活化片段即核心毒素，核心毒素與昆蟲中腸部位上皮細胞膜中高豐度的氨肽酶N受體和堿性磷酸酶受體等結合并被富集，然后與中腸上皮細胞刷狀緣膜囊泡上的受體結合并被剪切部分片段后發生構象改變，形成寡聚體并插入中腸細胞膜，繼而在腸細胞膜上形成允許離子和水分子自由出入的孔洞，導致水分大量流入細胞，引起中腸細胞膨脹裂解，最終導致昆蟲死亡[2]。也有人認為Cry蛋白還存在另一種殺蟲途徑： 即核心毒素通過與昆蟲中腸上皮細胞膜上的特殊受體結合，激活調控細胞凋亡相關基因的表達，導致中腸上皮細胞凋亡，從而引起昆蟲死亡。

Bt蛋白對昆蟲的毒力主要取決于昆蟲中腸上皮細胞刷狀緣膜囊上的受體，不同昆蟲中腸上皮細胞膜上的受體不同決定了Bt蛋白對不同昆蟲的選擇性毒性，受體與Bt蛋白核心毒素的高親和力決定了Bt蛋白作用的專一性。目前發現核心毒素的受體主要有類鈣粘蛋白、氨肽酶N、堿性磷酸酶以及糖脂等，均與核心毒素高度親和，其中類鈣粘蛋白的親和力最高，也是最重要的蛋白受體。

類鈣粘蛋白均為依賴鈣離子的跨膜糖蛋白家族，在機體中主要與細胞連接蛋白相互作用，并通過自身結構域調節細胞的信號轉導。類鈣粘蛋白與核心毒素特異性結合導致中腸細胞膜孔洞的形成，是引起昆蟲死亡的關鍵因素。不同昆蟲的類鈣粘蛋白與核心毒素的結合位點不完全一致，無法結合到類鈣粘蛋白受體關鍵區域的Bt蛋白將不能發揮作用[3]。因此，不同的Bt蛋白對不同昆蟲具有選擇性毒性，它是由昆蟲中腸上皮細胞受體與核心毒素之間的特異性識別并結合決定的。氨肽酶N、堿性磷酸酶及糖脂與類鈣粘蛋白作用機制相似，均是中腸上皮細胞膜上的重要受體。

長期種植轉Bt基因作物的地區，由于轉Bt基因抗蟲作物中持續高劑量的表達Bt蛋白，使得靶標昆蟲長期面臨來自Bt蛋白的生存壓力，會促使其產生對Bt蛋白的抗性。昆蟲中腸上皮細胞膜中特異性受體發生突變是抗性產生的主要原因，也是昆蟲抗性防治研究的重要方向。

3 Bt蛋白的安全性

Bt蛋白對人體是否安全是民眾關注的焦點。靶標昆蟲食用Bt蛋白導致死亡，那么人類食用Bt蛋白是否安全呢?檢驗Bt蛋白對人體是否具有潛在的威脅，主要看在食品加工過程或食用過程中Bt蛋白的結構與功能是否被破壞，以及人體消化道上皮細胞膜上是否存在與Bt蛋白或其在腸道內的降解產物特異性結合的受體。研究指出： 人體內胃液pH為0.9～1.8，在這種強酸環境下，Bt蛋白可被完全降解；Bt蛋白只有在強堿性條件下才會被部分降解成核心毒素片段，多數昆蟲中腸pH為9～10，而人小腸pH約為6.8，可見Bt蛋白會對多數昆蟲有毒性作用，但在人體內不會產生毒素；人類基因組與昆蟲基因組相差甚遠，昆蟲體內將Bt蛋白消化成核心毒素的酶以及昆蟲中腸上皮細胞膜上的特異性受體，在人體內均不存在；在60℃下加熱1min可以使Bt蛋白變性失活，因此Bt蛋白的正常攝入對人體沒有威脅。

轉基因蛋白的安全性不僅要考慮其毒性，還要考慮其致敏性，確定蛋白質是否具有致敏性的方法包括： 與已知過敏原比對氨基酸序列的同源性、進行模擬胃液消化實驗、與細胞表面抗原進行免疫實驗等。轉基因作物在推廣與應用之前，經過了嚴格的營養學、毒理學、致敏性以及非期望效應等安全評價程序，而且多年的應用并未發現明顯的不良后果，因此，批準上市的轉Bt基因作物及其種子被認為是安全的，可以正常食用。

轉Bt基因作物的安全性問題可能主要在于其對環境和生物多樣性方面的影響。利用Bt蛋白對抗昆蟲雖然是農業生產的巨大進步，但其對生物多樣性與環境是否安全目前尚未有定論，主要有三個方面的問題： 第一，雖然Bt蛋白抗蟲譜窄，只對靶標昆蟲有較大影響，但殺害靶標昆蟲，可通過食物鏈影響這些昆蟲的捕食者及其他生物，使其數量增加或減少，影響生態平衡與生物多樣性；第二，Bt蛋白通過植物的花粉、根系或殘渣進入土壤，可與土壤黏粒和腐殖酸結合，形成不易被微生物降解且具有殺蟲活性的結合態Bt蛋白，使土壤生物多樣性等受到不同程度的影響[4]；第三，Bt蛋白對昆蟲長期的生存壓力易使其產生抗性，一旦大部分昆蟲產生抗性，轉Bt基因作物將失去其意義，再次大量使用殺蟲劑將造成環境污染。目前，轉基因作物的種植年限尚短，缺乏其對環境影響的長期研究，尚不能做出Bt蛋白對生物多樣性與環境安全性的精準評價。

[基金項目： 教育部人文社會科學研究項目規劃基金“核心素養導向的科學課程高中學業水平考試實施策略與命題研究(2017—2020年)”；*通信作者]