核移植胚胎干細(xì)胞的制備、特性和應(yīng)用概述

征月良

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 臨沂 276000)

近年來(lái)，核移植技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)利用此技術(shù)獲得了多種克隆動(dòng)物。核移植后，從克隆胚胎中分離、培育而成的干細(xì)胞稱為核移植胚胎干細(xì)胞(nuclear transfer embryonic stem cells，NTESC)，這種細(xì)胞對(duì)于胚胎嵌合研究和細(xì)胞治療研究均具有重要的意義。本文概述NTESC的制備、特性和應(yīng)用。

1 NTESC的制備

小鼠的NTESC來(lái)自克隆胚胎。將小鼠成纖維細(xì)胞核或卵丘細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞，并在核移植胚胎發(fā)育至囊胚時(shí)除去囊胚的透明帶，放在含有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)就可獲得NTESC，接著便可以使用胰酶消化法對(duì)NTESC進(jìn)行傳代。核移植后，從克隆胚胎中制備第1個(gè)NTESC系。用第1個(gè)NTESC系作為核供體細(xì)胞，進(jìn)行第2次核移植，獲得第2個(gè)NTESC系。以此方法可制備多個(gè)NTESC系[1]。核移植后，克隆胚胎可以發(fā)育至囊胚，但是大部分胚胎不能建立正常的胎盤(pán)組織，導(dǎo)致胎兒發(fā)育異常或停止，這可能是由某些基因組重編程錯(cuò)誤所引起。重編程錯(cuò)誤會(huì)影響囊胚滋養(yǎng)層的功能，滋養(yǎng)層功能下降不利于正常胎盤(pán)的形成，影響克隆胚胎的植入和發(fā)育。但是，研究發(fā)現(xiàn)只要克隆囊胚中存在功能正常的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，就可以用這部分細(xì)胞制備N(xiāo)TESC[2]。在克隆胚胎中，常出現(xiàn)一些表觀遺傳錯(cuò)誤，導(dǎo)致胎盤(pán)發(fā)育失敗，而NTESC的獲得不需要胎盤(pán)，甚至可從注定要死亡的胚胎中制備N(xiāo)TESC，這是NTESC相對(duì)于胚胎干細(xì)胞的一大優(yōu)勢(shì)[1]。

小鼠NTESC的制備方法基本上適用于人NTESC的培育，但需對(duì)卵母細(xì)胞去核、融合、激活方案進(jìn)行優(yōu)化： 在人卵母細(xì)胞去核過(guò)程中，卵母細(xì)胞需用咖啡因處理，以防止過(guò)早活化；用作核供體細(xì)胞的人成纖維細(xì)胞需先用滅活血凝病毒處理，然后放到去核卵母細(xì)胞的卵周隙中，使其與卵母細(xì)胞融合，獲得成纖維細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞的重構(gòu)體；對(duì)重構(gòu)體需先用電脈沖進(jìn)行激活，然后培養(yǎng)于含有二甲基氨基嘌呤的培養(yǎng)液中，獲得克隆胚胎，克隆胚胎發(fā)育成囊胚，便可以用來(lái)制備人的NTESC[3]。

用小鼠成纖維細(xì)胞或卵丘細(xì)胞進(jìn)行核移植，均能得到有正常核型、呈現(xiàn)堿性磷酸酶活性的小鼠NTESC[1]。NTESC既可由同種核移植胚胎獲得，也可用異種核移植胚胎制備。將人成纖維細(xì)胞與去核兔卵母細(xì)胞融合后培育成異種克隆胚胎，進(jìn)一步培育就可以獲得人—兔異種NTESC。

2 NTESC的特性

2.1 表達(dá)階段特異性胚胎抗原和腫瘤排斥抗原 NTESC在體外培養(yǎng)時(shí)，能形成類(lèi)胚體。在類(lèi)胚體的外部細(xì)胞中會(huì)出現(xiàn)三類(lèi)特異性蛋白的表達(dá)： ①巢蛋白和烯醇酶等外胚層細(xì)胞標(biāo)志；②肌血紅素、平滑肌肌動(dòng)蛋白以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體等中胚層細(xì)胞標(biāo)志；③甲胎蛋白和抗胰蛋白酶等內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)志[4]。

2.2 具有分化能力 將小鼠NTESC注射到小鼠的腹膜中，形成的畸胎瘤含有三個(gè)胚層，可分別分化成神經(jīng)元、腸上皮、軟骨及脂肪組織[5]。用來(lái)制備N(xiāo)TESC的小鼠克隆胚胎通常具有發(fā)育成后代的潛能，但小鼠孤雌胚胎不能發(fā)育成后代。這種孤雌胚胎可用來(lái)獲得孤雌胚胎干細(xì)胞，并將其作為核供體進(jìn)行核移植，制備孤雌NTESC，所得孤雌NTESC也可分化成神經(jīng)元和中胚層細(xì)胞。例如，將孤雌NTESC注入小鼠受精囊胚，可產(chǎn)生嵌合體小鼠，在嵌合體小鼠的大腦、肝臟、腎臟、心臟、腸及皮膚中，由孤雌NTESC分化來(lái)的細(xì)胞比例為2%～8%[6]。

2.3 表現(xiàn)線粒體的異質(zhì)性 研究表明，人—兔異種NTESC表現(xiàn)人和兔線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)共存的現(xiàn)象[4]。用人成纖維細(xì)胞與去核人卵母細(xì)胞進(jìn)行融合，并對(duì)卵母細(xì)胞去核、融合、激活方案進(jìn)行優(yōu)化，可獲得人NTESC。這種人NTESC的核基因組來(lái)自核供體細(xì)胞，而絕大多數(shù)mtDNA來(lái)自卵母細(xì)胞，也就是說(shuō)人NTESC具有線粒體的異質(zhì)性。這一現(xiàn)象是由于核供體細(xì)胞和去核卵母細(xì)胞融合過(guò)程中，供體細(xì)胞mtDNA一同轉(zhuǎn)移進(jìn)克隆胚胎的緣故[3]。

3 NTESC的應(yīng)用

3.1 用于胚胎嵌合研究 NTESC能無(wú)限增殖，又具有分化的潛能，這些特性使NTESC在胚胎嵌合研究上有重要應(yīng)用。將小鼠NTESC注入二倍體囊胚的囊胚腔中，可得到嵌合體小鼠。后代小鼠的細(xì)胞來(lái)自NTESC和宿主二倍體囊胚。將小鼠NTESC注入四倍體囊胚中，也能得到小鼠后代，但這種后代的細(xì)胞來(lái)自NTESC[7]。NTESC既可用正常小鼠來(lái)制備，也可由突變小鼠來(lái)獲得。雌雄同體不育性突變小鼠有精巢和卵巢，具有一條異常Y染色體，不能形成生殖細(xì)胞，因而是不育的。這種不育性突變小鼠對(duì)于發(fā)育生物學(xué)的研究具有重要意義，但通過(guò)核移植方法對(duì)這種小鼠進(jìn)行克隆難以成功。若先用這種小鼠的尾尖細(xì)胞進(jìn)行核移植，從克隆囊胚中獲得NTESC，再用NTESC進(jìn)行核移植，也不能產(chǎn)生克隆后代。如果將NTESC注入二倍體受精囊胚，可得到嵌合體后代。在嵌合體小鼠中，來(lái)自NTESC的精子生發(fā)細(xì)胞能產(chǎn)生含X染色體的精子，受精后產(chǎn)生雌性后代，但精子生發(fā)細(xì)胞不能將異常Y染色體傳遞到下一代中，因此不能產(chǎn)生雄性不育小鼠。若通過(guò)四倍體胚胎嵌合的方法，將NTESC注入四倍體囊胚的囊胚腔中，可產(chǎn)生來(lái)自NTESC的后代，它們有異常Y染色體，不能產(chǎn)生生殖細(xì)胞，是不育的[8]。

3.2 用于細(xì)胞植入法疾病治療研究 NTESC能分化成其他類(lèi)型的細(xì)胞，從而用于細(xì)胞治療研究。將源自小鼠成纖維細(xì)胞的NTESC植入患糖尿病的小鼠后，NTESC能分化成胰腺β細(xì)胞，能對(duì)葡萄糖刺激發(fā)生反應(yīng)，釋放胰島素，從而使患病小鼠的血糖水平恢復(fù)正常[5]。用自然殺傷T細(xì)胞作核供體進(jìn)行核移植，得到的NTESC能分化成NKT細(xì)胞。將這些NKT細(xì)胞注射進(jìn)小鼠中，這些細(xì)胞在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的干擾素γ能抑制接種的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。

4 結(jié)語(yǔ)

用患者自身的細(xì)胞進(jìn)行核移植，可從后續(xù)工作中獲得克隆胚胎，并從克隆胚胎中制備患者自身的NTESC。這種自身NTESC分化產(chǎn)生的功能細(xì)胞在核基因型上等同于供體細(xì)胞(即患者自身的細(xì)胞)，移植后可大大減少免疫排斥反應(yīng)，從而為移植醫(yī)學(xué)的研究開(kāi)辟了一條重要途徑。對(duì)于患有線粒體疾病的人來(lái)說(shuō)，可用其體細(xì)胞進(jìn)行核移植，來(lái)獲得其自身的NTESC進(jìn)行細(xì)胞移植治療。盡管患者的mtDNA存在異常，但移植用NTESC中絕大多數(shù)mtDNA來(lái)自卵母細(xì)胞，用這樣的NTESC進(jìn)行細(xì)胞治療，為挽救因mtDNA突變引起的細(xì)胞代謝功能異常的患者提供了一種新的方法。但是，需要特別指出，為了制備人NTESC需要獲得捐贈(zèng)人卵母細(xì)胞時(shí)，要嚴(yán)格履行知情同意原則，而且在獲得克隆胚胎后，更要嚴(yán)格防止將用于制備N(xiāo)TESC的胚胎用于克隆人。另外，NTESC應(yīng)用于移植治療的安全性也需要進(jìn)一步研究。