藥用植物多態性研究進展

沈徐婷，丁志山

(浙江中醫藥大學 醫學技術學院，浙江 杭州 310053)

1 引言

藥用植物是體內含有某些有效成分的一類植物，可用于預防和治療疾病，是中藥材的主要來源。幾千年來，藥用植物在自然條件或人為因素下經歷了產地遷徙和雜交變種，使其種類和價值更加多樣，豐富了藥用植物多態性。然而，由于藥用植物被破壞性采集，野生資源急劇減少，急需對其多態性現狀進行研究，為保護藥用植物野生資源提供理論依據，挽救其資源日漸枯竭的現狀。

藥用植物多態性，包括物種多樣性、生態環境多樣性和遺傳多樣性。遺傳多樣性是藥用植物多態性的基礎和核心，具體表現在形態學、細胞學、生物化學和DNA分子生物學層面。本研究基于已有文獻資料，對藥用植物多態性研究技術與應用進行綜述與展望。

2 藥用植物多態性研究技術

2.1 同工酶分析技術

目前，已有100多種同工酶被研究，其中藥用植物方面研究中最為常見的有過氧化物酶、超氧化物歧化酶、酯酶和過氧化氫酶等。同工酶標記法憑借其酶活性不易丟失，技術簡單，材料豐富和成本較低等優點已經成為檢測藥用植物遺傳多態性的主流方法之一。同工酶分析技術使用電泳和組織化學方法特異性地染色和分離酶蛋白分子，并直接標記染色區帶中的相應位置和活性。它包括了同工酶的分離、染色、酶譜分析與聚類分析四個步驟，其中聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(PAGE)憑借其操作簡單、分辨率高、同工酶活性不易丟失等優點，成為同工酶分離的主流技術。

劉賀賀等[1]利用PAGE分析了75份蕨麻種質資源，建立POD同工酶酶譜進行差異性研究，并與形態學、分子學、細胞學結果比較，證實了蕨麻為適應復雜的地理環境發生了進化，形成了復雜的遺傳變異和遺傳資源多樣性。

2.2 DNA甲基化分析技術

DNA甲基化分析技術包括檢測特異性位點甲基化與全基因組甲基化兩類,特異性位點甲基化中，最為常用的是亞硫酸鹽測序法。全基因組甲基化檢測方法主要包括甲基化敏感的擴增片段長度多態性法(MSAP)、甲基化敏感的限制性內切酶結合Southern印跡分析和甲基化特異性單核苷引物延伸(Ms-SNu PE)等。目前以MSAP技術在藥用植物甲基化研究中使用更為廣泛。

MSAP是一類用于研究生物體DNA甲基化狀態的技術，是DNA甲基化定位和差異甲基化基因定位克隆的有效方法。使用限制酶MspⅠ和HpaⅡ消化和識別甲基化胞嘧啶能力的差異，將相同的DNA序列擴增出不同譜帶，以此推斷DNA的5'-CCGG位點的胞嘧啶甲基化狀態和程度[2]。

Bednarek, P. T.等[3]提出了一種新的甲基化敏感擴增多態性(MSAP)方法，用于評估CCGG序列甲基化狀態的相對定量特征，該方法還可用于分析影響CG和CHG情況的甲基化事件，植物在Al脅迫下差異甲基化。這種方法為研究植物非生物脅迫提供了有價值的工具。

Chwialkowska, K. 等[4]通過使用新一代測序(NGS)和自動化數據分析，使用高通量測序取代傳統的聚丙烯酰胺凝膠上擴增子的分離，改進了基于MSAP的方法，稱為甲基化敏感擴增多態性測序(MSAP-Seq)。MSAP-Seq允許基于全局序列的DNA甲基化變化鑒定。通過將高通量測序結合到MSAP-Seq中，可以在整個基因組中的數十萬個位點進行DNA甲基化的平行和直接分析，可直接提供基因組定位的變化，并實現了定量評估。

2.3 指紋圖譜分析技術

指紋圖譜是指通過一些技術手段分析加工的復合物質，以及獲得的能夠代表其分子生物學或化學特征的光譜或色譜圖。指紋圖譜技術可廣泛應用于某種生物體的DNA或蛋白質等，其中中藥指紋圖譜被廣泛應用于中藥鑒定、區分類別和分析有效成分等方面。該領域的分析技術包括高效液相色譜、核磁共振波譜、電化學方法、薄層色譜、氣相色譜、紫外光譜和紅外光譜等，常用的分析技術是高效液相色譜、薄層色譜和DNA指紋圖譜。

2.3.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)作為一種高效的定性和定量檢測方法，其原理是根據待測混合物中的各個組分在固定相和流動相之間分配比例的不同，從而達到成分分離的目的。它廣泛應用于中藥化學成分的檢測，具有自動化程度高、分離效果好、靈敏度高、結果準確等優點。Doshi, G. M.[5]用高效液相色譜法(HPLC)確定了槲皮素和蘆丁在冬瓜種子和假虎刺根中的具體含量。該技術還可獨立應用于各成分的分離分析，在與質譜等技術聯合使用時分析效果更為顯著[6]。

2.3.2 薄層色譜法

薄層色譜法(TLC)是一種吸附薄層色譜色譜法，它利用相同吸附劑對每種組分的吸附容量的差異，在移動相(溶劑)流過固定相(吸附劑)的過程中使各組分相互分離。TLC作為鑒別藥用植物最常用的方法，具有設備簡單、操作方便、靈敏度好、顯色容易等優點。依靠薄層板上是否存在斑點可以確定藥材的真實性[7]，斑點顏色的深度及大小也可以在一定程度上反映出藥材的質量。2015年版中國藥典一部附錄中的部分中藥仍在使用TLC進行藥材的鑒別分類。

2.3.3 DNA指紋圖譜

DNA指紋圖譜揭示了DNA分子層面上的多態性。該法使用特異性基因探針與片段雜交以獲得特征性帶型，即DNA指紋圖譜，并與另一個體的DNA指紋圖譜比較以評價個體DNA相似度的技術。DNA指紋圖譜依托DNA分子標記法得以構建，基于分子雜交、PCR、特異標記等不同原理，發展得到擴增片段長度多態性(AFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)、簡單重復序列(SSR)、ISSR、單核苷酸多態性(SNPs)等多種方法。

擴增片段長度多態性(AFLP)技術結合了RFLP的優勢，將引物識別序列連接到限制性DNA上，進行限制性片段的選擇性PCR擴增。RAPD是與PCR技術基本原理相同的一類隨機擴增多態性DNA標記技術。簡單重復序列(SSR)又名微衛星DNA，是一類由1-6個核苷酸串聯組成的重復單元。ISSR標記在SSR基礎上發展而來，是一種新型分子標記，具有無需知道DNA序列、顯性標記、重復性好等特點。單核苷酸多態性(SNPs)是群體個體的基因組序列中的單核苷酸堿基變異，形成遺傳標記。Bhattacharyya等[8]為解決金釵石斛資源稀缺的現狀，通過ISSR和DAMD標記對蘭科類群進行了指紋圖譜分析，并對總酚類、黃酮類和生物堿類成分進行了估算，揭示了整個樣本群體顯著水平的變異性。

3 藥用植物多態性研究現狀

隨著對藥用植物多態性的逐漸重視,已經有越來越多的藥用植物在各個層次有了初步的多態性研究,而且必將會繼續探索新的植物。表1列出了常見藥用植物多態性研究情況，主要有蘭科、豆科、五加科、毛茛科和傘形科。

4 藥用植物多態性的應用

4.1 鑒定藥用植物品種

藥用植物多態性的研究可為品種鑒定、近緣植物鑒別與種群內親緣關系追溯提供科學可靠的依據。DNA指紋圖譜可直接、明確地鑒定品種；HPLC指紋圖譜可從化學成分的角度提供識別依據，廣泛應用于中草藥的質量控制；同工酶指紋圖譜可揭示種群內親緣關系。陳云[21]利用HPLC對10批葛根藥材進行檢測，結果顯示，僅有3批藥材達到質量標準，其余均未達標；溫強等[22]采用ISSR分子標記技術對紫花含笑進行鑒別，只用一個標記就可將紫花含笑與其他4個近緣種植物區分開來，同時獲得的特異位點可將3個紫花含笑新品種區分出來。

4.2 指導改善藥用植物的經濟性狀

根據藥用植物所呈現的性狀差異，推測影響其呈現多態性的因素，或利用雜交技術賦予其雜種優勢，以改善藥用植物的性狀，提高藥效成分含量；藥效成分與藥效學、藥代動力學等相關研究的結合，為推動藥用植物的臨床應用開辟新途徑。目前已有大量研究顯示，低溫、肥力調控、增強光照和干旱脅迫等都能誘導提高藥用植物黃酮類藥效成分[23]。李曉瓊等[24]通過桉樹雜交分別培育出了感蟲性增加和抗蟲性的子代桉樹。

4.3 指導保護藥用植物的種質資源

通過研究各種藥用植物的生長特點和地域分布，可以指導栽培技術，制定優先保護策略，從而更好地保護藥用植物的種質資源。李林軒等[25]發現，利用發根農桿菌R1601感染山豆根無菌苗子葉，在固體培養基上培養可誘導產生毛狀根，且誘導率最高，毛狀根在1/2 MS+IAA0.5 mg/L+5%蔗糖的培養液中生長情況最佳；Pe as 等[26]在研究了伊比利亞半島、摩洛哥、加那利群島的黃芪后，認為在伊利比亞范圍內，保護研究中編號為AE4和AE5群體樣品可保證伊比利亞特有單倍型III和V的保存，保護加那利群島的AE16將確保單倍型VII的保存，在摩洛哥境內可以優先保護AE10和AE11。

4.4 優化藥用植物的地理分布

同一藥用植物栽培在不同產地，會在不同環境條件中逐漸呈現多態性。某些藥用植物在特定地域表現出優良的性狀與品質，被稱為道地藥材，這為優化藥用植物的地理分布提供了思路。徐菲等[27]通過HPLC技術對不同產地的石虎藥效成分含量進行分析對比，構建石虎的適宜產區規劃圖，得出重慶、湖南、貴州的適宜種植區較大的結論。楊月等[28]為研究土壤中無機元素與三七藥材品質的相關性，從云南省文山州、紅河州、玉溪市和曲靖市4個產地的16個樣品中采集種植三七的根和根際土壤,經過HPLC等技術分析了三七藥效成分的差異，得出三七種植應選擇Mg、K含量較高的土壤。

4.5 推測藥用植物的歷史發展過程

生物居群遺傳變異的大小與其進化速度有著密不可分的關系，因而，對藥用植物多態性的研究可推測其歷史演變和進化過程，結合其生境還可以推測生境變化過程。例如，Zhao等[29]通過姜科距藥姜屬(Cautleya)和象牙參屬(Roscoea)的演化歷史分析,發現兩個屬大約起源于44 Ma(Ma即百萬年)，在32 Ma發生分化，而隨著喜馬拉雅-青藏高原的第三次隆升(23 Ma)及其相伴的中南半島快速側向滑動，兩個屬的祖先分布區被“撕裂”成兩個不連續的區域，此后異域分化為完全不同的類群。這兩個屬的演化歷史正好映射了喜馬拉雅-青藏高原早期不同隆升階段的地質過程及其對植物多樣性演化的影響。基于報春花屬(Primula)的Armerina組和蔥屬(Allium)的Cyathophora亞屬的研究表明，兩個類群的分化大約發生在4-3Ma，推測是最后一次青藏高原隆升和橫斷山隆起形成的地理隔離障礙促進了屬內物種分化[30]。

5 展望

隨著疾病發生發展的多樣化和復雜化，天然藥用植物的臨床需求逐年上升，其野生資源卻日漸匱乏，尋找有效的保護措施迫在眉睫，其中，研究其多態性是保護藥用植物資源的必要手段。通過分析藥用植物多態性的現狀及其變化趨勢，并進一步探討其理論基礎，可為優化稀缺藥用植物的栽培育種提供科學依據，為臨床需求量大、價值高的藥用植物的臨床應用提供可靠保障。加之部分藥用植物品系難以憑借經驗區分，所以亟待通過研究藥用植物多態性以建立科學的鑒別手段，明確其分類體系。綜上所述，藥用植物的多態性研究極具現實意義和應用前景，急需對更多的藥用植物的多態性進行研究。