催產素在杏仁核內對攝食的調節作用

朱永香　王倩　徐燕

[摘要]目的 觀察催產素（OT）在杏仁核內對攝食的調節作用。方法 選取48只雄性SD大鼠，將其中16只隨機分為自由攝食組與禁食72 h組，每組各8只，應用免疫組織化學方法檢測大鼠杏仁核內OT受體的表達。剩余32只大鼠行杏仁核內套管植入術，術后將其中16只大鼠隨機分為兩組，分別為杏仁核內注射OT組及杏仁核內注射生理鹽水1組，每組各8只，分別檢測大鼠0.5、1、2、3 h內的攝食量；另外16只術后大鼠隨機分為兩組，分別為杏仁核內注射催產素受體阻斷劑（Atosiban）組及杏仁核內注射生理鹽水2組，每組各8只，分別檢測大鼠0.5、1、2、3 h內的攝食量。結果 禁食72 h組大鼠的杏仁核內OT受體表達高于正常攝食組，差異有統計學意義（P<0.05）；杏仁核內注射OT組大鼠0.5、1、2、3 h內的攝食量低于杏仁核內注射生理鹽水1組，差異有統計學意義（P<0.05）；杏仁核內注射Atosiban大鼠0.5、1、2、3 h內的攝食量高于杏仁核內注射生理鹽水2組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 OT在杏仁核內通過作用于其受體參與了攝食的調節作用。

[關鍵詞]催產素；杏仁核；催產素受體阻斷劑；攝食

[中圖分類號] R395.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）8（a）-0004-04

Regulation of Oxytocin on feeding in the amygdaloid nucleus

ZHU Yong-xiang WANG Qian XU Yan YU Wei NAN Ying CAO Jian

Teaching and Research Room of Physiology， Department of Basic Medicine， Xi'an Medical University， Shanxi Province， Xi'an 710021， China

[Abstract] Objective To observe the regulation of Oxytocin （OT） on feeding in the amygdaloid nucleus. Methods Forty-eight male Sprague-Dawley （SD） rats were selected. Among them， 16 rats were randomly divided into free-feeding group and 72-hour fasted group， with 8 in each group. Immunohistochemistry was used to detect the expression of OT receptors in the rat amygdala. The remaining 32 rats were subjected to cannula implantation in amygdala and 16 of them were randomly divided into two groups， namely the injected with OT in amygdaloid nucleus group and the injected with normal saline in amygdaloid group 1 respectively， 8 rats in each group. Food intake was measured in rats at 0.5， 1， 2， and 3 h. Another 16 postoperative rats were randomly divided into two groups， namely the injected with OT receptor blocker （Atosiban） in amygdaloid nucleus group and the injected with normal saline in amygdaloid group 2 respectively， 8 rats in each group. Similarly， food intake of the rats was measured at 0.5， 1， 2， and 3 h. Results The expression of OT receptors in the amygdaloid nucleus of rats in the 72-hour fasted group was significantly higher than that in the normal feeding group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The food intake of rats of injected with OT in amygdaloid nucleus group at 0.5， 1， 2， and 3 h were lower than those in the injected with normal saline in amygdaloid group 1， and the differences were statistically significant （P<0.05）.The food intake of rats of injected with Atosiban in amygdaloid nucleus group at 0.5， 1， 2， and 3 h were higher than those in the injected with normal saline in amygdaloid group 2， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion OT participates in feeding regulation in the amygdaloid nucleus through acting on its receptors.

[Key words] Oxytocin； Amygdaloid nucleus； Atosiban； Food intake

催產素（Oxytocin，OT）是由下丘腦室旁核及視上核神經元合成的一種激素，部分OT通過神經元軸突運輸至神經垂體儲存，當機體需要時，將在此處被分泌至循環系統。下丘腦室旁核內合成OT的部分神經元軸突投射至其他腦區，如下丘腦腹內側核、下丘腦背內側核、杏仁核、內側和外側隔核、海馬背側及腹側、藍斑核、孤束核、迷走神經背運動核等。OT受體廣泛分布在與食欲調控相關的腦區，如杏仁核、下丘腦腹內側核、下丘腦背內側核以及孤束核等。

OT的主要生理作用是在孕婦分娩過程中，促進子宮強烈收縮加速產程，在婦女哺乳期間，促進乳腺排出乳汁。然而，近年來的研究表明，OT具有強烈的抑制動物攝食及降低體重的作用[1-4]。厭食癥患者的發病機制與OT對攝食的調控有關[5]。正常人鼻腔給予OT后，食物的攝入量明顯減少，而肥胖患者鼻腔給予OT后，體重會明顯降低，并未出現顯著的副作用[6-8]。因此，OT有可能成為人類肥胖防治的一種新藥。但關于OT抑制攝食的中樞機制研究還不明確。杏仁核是邊緣前腦中與攝食調控關系密切的核團之一。杏仁核內既有OT神經纖維的投射，也有OT受體的分布，那么，有理由推測，OT在中樞神經系統內對攝食的調節作用可能與杏仁核的攝食調控作用密切相關。因此，本研究檢測了大鼠能量攝入不足時，OT受體在杏仁核內的表達變化，探索杏仁核內OT受體在能量攝入調節中的作用；大鼠杏仁核內注射OT，檢測大鼠攝食量的變化，探索外源性OT在杏仁核內對攝食的調節作用；最后，大鼠杏仁核內注射催產素受體阻斷劑（Atosiban），檢測大鼠攝食量的變化，探索內源性OT在杏仁核內對攝食的調節作用，本研究旨在為闡明OT對攝食調控的中樞機制提供創新性研究資料，現報道如下。

1對象與方法

1.1實驗動物

本研究選用西安交通大學醫學院實驗動物研究中心提供的健康、活潑的48只雄性Sprague-Dawly（SD）大鼠，初始體重220～250 g。所有大鼠均分籠喂養，采用顆粒型大鼠飼料喂養，飲用自來水，室溫21～25℃。

1.2主要儀器與試劑

主要試劑：OT及Atosiban（美國Sigma公司），兔抗催產素受體抗體（Santa Cruz公司），DAB試劑盒（北京中杉生物技術有限公司），羊抗兔SP試劑盒（北京中杉生物技術有限公司）。主要儀器：光學顯微鏡（Olympus，BX51），大鼠腦立體定位儀（日本NARISHIGE公司，SN-3）及圖像分析軟件（Image-Pro Plus）等。

1.3實驗分組及處理

1.3.1禁食對杏仁核內催產素受體表達的影響 從48只SD大鼠中選取16只，將其隨機分為兩組，分別為自由攝食組與禁食72 h組，每組各8只。自由攝食組大鼠自由攝食，禁食72 h組大鼠禁食72 h，大鼠腹腔注射水合氯醛（40 mg/kg）麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，將插管經左心室插入主動脈內并固定，100 ml生理鹽水迅速灌流，450 ml多聚甲醛固定液（40 g/L）繼續灌流約2 h。取鼠腦置于4℃固定液4～6 h，再移入蔗糖溶液（200 g/L）約12 h。取出鼠腦做冰凍切片，厚度約40 μm，0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗腦片。0.3%（ml/L）的H2O2孵育腦片30 min，洗腦片每次5 min，共3次，正常山羊血清封閉60 min。將腦片置入4℃兔抗大鼠OT受體抗體（1：300）孵育36 h，PBS沖洗，移入羊抗兔IgG（1：300）中1 h，PBS沖洗。移入S-A/HRP中1 h，PBS沖洗。DAB顯色，將腦片裱于載玻片上，自然晾干后，酒精脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.3.2杏仁核內植入不銹鋼套管術 剩余32只SD大鼠行杏仁核內套管植入術。將其腹腔注射水合氯醛（40 mg/kg）麻醉后，固定于鼠腦立體定位儀上，將不銹鋼套管植入大鼠左側杏仁核上方2.0 mm處（前囟后2.4 mm，向左旁開4.1 mm，硬腦膜下5.0 mm）植入套管，將3個不銹鋼小螺絲固定于顱骨上，牙科水泥固定套管。術后大鼠腹腔內注射青霉素（每只20萬單位/次）預防感染，待大鼠傷口痊愈、狀態良好時開始后續實驗。

1.3.3外源性催產素注射至杏仁核內對攝食量的影響 將16只術后痊愈的大鼠隨機分為兩組，每組各8只。其中一組大鼠食物撤去24 h后，采用微量注射器予大鼠杏仁核內注射生理鹽水（杏仁核內注射生理鹽水1組），另一組大鼠杏仁核內注射OT 10 μg（杏仁核內注射OT組）。分別檢測兩組大鼠0.5、1、2及3 h內的攝食量。注射時，微量注射器針尖在套管下方2.0 mm處，注射時間持續2 min，注射完畢后，注射器要停留在杏仁核內2 min。

1.3.4杏仁核內注射催產素受體阻斷劑對攝食量的影響 將另外16只術后痊愈的大鼠隨機分為兩組，每組各8只。其中一組大鼠食物撤去24 h后，采用微量注射器予大鼠杏仁核內注射生理鹽水（杏仁核內注射生理鹽水2組），另一組大鼠杏仁核內注射Atosiban 20 μg（杏仁核內注射Atosiban組）。分別檢測以上兩組大鼠0.5、1、2、3 h內的攝食量。注射時，微量注射器針尖在套管下方2.0 mm處，注射時間持續2 min，注射完畢后，注射器要停留在杏仁核內2 min。

1.3.5杏仁核定位 實驗結束后，大鼠腹腔注射水合氯醛（40 mg/kg）進行麻醉后，經套管注射旁胺天藍，注射完畢后微量注射器停留2 min，將大鼠灌流固定，斷頭取腦，將鼠腦放入10%多聚甲醛中固定約1 d，取鼠腦做冰凍切片，厚度40 μm，中性紅染色，酒精脫水，二甲苯透明，對照大鼠腦定位圖譜，10×10光鏡下觀察注射位置，位置不準確的數據排除實驗。

1.4統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1禁食72 h組與正常攝食組大鼠杏仁核內OT受體表達的比較

光鏡下杏仁核內OT受體陽性神經元的細胞膜上出現黃色顆粒。自由攝食組大鼠杏仁核內OT受體陽性神經元染色較淺，平均光密度值為0.3015±0.0127；禁食72 h組大鼠杏仁核內OT受體免疫反應陽性神經元染色較深，平均光密度值為0.4102±0.0305。禁食72 h組大鼠的杏仁核內OT受體表達高于正常攝食組，差異有統計學意義（P<0.05）（圖1）。

2.2杏仁核內注射OT組與注射生理鹽水1組大鼠不同時間攝食量的比較

杏仁核內注射OT組大鼠0.5、1、2、3 h內的攝食量均低于杏仁核內注射生理鹽水組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3杏仁核內注射Atosiban組與注射生理鹽水2組大鼠不同時間攝食量的比較

杏仁核內注射Atosiban大鼠0.5、1、2、3 h內的攝食量均高于杏仁核內注射生理鹽水組，差異有統計學意義（P<0.05）（表2）。

3討論

OT是由9個氨基酸組成的神經激素，能夠促進分娩過程中孕婦子宮強烈收縮從而加速產程，也可促進哺乳期婦女乳腺排出乳汁。另外，OT還與神經退行性疾病的發病機制有關[9]，并參與社會認知過程[10-11]，也參與體液平衡的調節機制[12]。然而，最近的研究熱點集中在OT對攝食的調節作用[13-14]。大鼠側腦室或外周注射OT均呈劑量依賴性地減少攝食、降低體質量。人體鼻腔內給予OT可抑制獎賞驅動的食物攝入[6]。厭食癥患者外周OT水平明顯升高，導致其食欲降低。相反，普拉德威利綜合癥患者下丘腦室旁核內表達OT的神經元數量明顯減少，導致其攝食過多，出現病態肥胖。最近研究顯示，兒童肥胖與OT受體多態性有關[15]。以上研究表明，OT對動物及人類均具有明顯抑食及降低體質量的作用，并與人類營養代謝異常疾病密切相關，因此，OT可能成為人類營養代謝異常疾病防治的一種新藥。

由于OT神經元軸突投射至大腦的多個區域，這些區域既參與攝食的獎賞機制，也參與能量平衡的調節作用，因此，OT對攝食調節的機制是復雜的[16]。研究證實OT在下丘腦腹內側核對攝食具有抑制作用[17]，提示OT在下丘腦內可能參與能量平衡的調控機制。OT在腹側被蓋區和伏核能抑制可口性食物的攝入[18-19]，提示OT可通過抑制獎賞作用減少食物攝入。最近有研究指出，OT可通過增強人類認知控制能力抑制食物的攝入[20]。杏仁核是邊緣前腦中與攝食行為調控關系密切的核團之一。神經肽Y、胃促生長素等在杏仁核內均具有調節攝食的作用。杏仁核內既有OT神經纖維末梢的投射，也有OT受體的分布，由此推測，OT在杏仁核內可能同樣參與攝食的調控過程。

為確定催產素在中樞神經系統內對攝食的調節作用是否與杏仁核有關，本研究選取其中一組大鼠禁食72 h，減少大鼠的能量攝入，檢測催產素受體在杏仁核內的表達變化。本研究結果提示，禁食72 h組大鼠的杏仁核內OT受體表達高于正常攝食組，差異有統計學意義（P<0.05）。這是由于能量攝入不足時，下丘腦室旁核內OT的合成和釋放減少，運輸至杏仁核的OT也相應減少，從而導致OT受體在杏仁核內的表達上調，提示杏仁核內的OT受體參與大鼠攝食調節的過程。

為確定OT在杏仁核內對攝食調節的直接作用，本研究給兩組禁食24 h大鼠杏仁核內分別注射外源性OT和生理鹽水，于0.5、1、2、3 h內檢測大鼠的攝食量。結果提示，杏仁核內注射OT組大鼠0.5、1、2、3 h內的攝食量低于杏仁核內注射生理鹽水2組，差異有統計學意義（P<0.05）。提示外源性OT在杏仁核內對攝食具有抑制作用，并且其減少攝食的作用起效較快，持續時間也比較長，之后應進一步延長觀察時間，以檢測OT在杏仁核內對攝食抑制作用的最長持續時間。

為確定內源性OT在杏仁核內對攝食的調節作用，本研究給兩組禁食24 h大鼠杏仁核內分別注射20 μg Atosiban和生理鹽水，于0.5、1、2、3 h內檢測大鼠的攝食量。結果提示，杏仁核內注射Atosiban的大鼠0.5、1、2、3 h內攝食量高于杏仁核內注射生理鹽水2組，差異有統計學意義（P<0.05）。提示Atosiban與OT競爭占據了杏仁核內的OT受體，從而阻斷內源性OT在杏仁核內對攝食的調節作用，導致大鼠攝食量增多。由此推測，內源性OT在杏仁核內對大鼠的攝食具有抑制性調節作用。

綜上所述，本研究將OT對攝食的調節作用與杏仁核對攝食的調節作用關聯起來，為OT在中樞神經系統內對攝食的調節作用提供了新的研究資料，但OT在杏仁核內對攝食的具體調節機制尚不清楚，未來應進一步研究OT在杏仁核內對攝食的調節作用是否與味覺感受、情緒反應以及杏仁核內調節攝食的其他激素或神經遞質有關。

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（收稿日期：2018-05-09 本文編輯：孟慶卿）