1,25-二羥維生素D3減輕幼鼠海水吸入性肺損傷中組織水腫的機制

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(空軍軍醫大學第一附屬醫院兒科，陜西 西安 710032)

海水淹溺是引起意外性死亡的常見因素之一。據世界衛生組織統計，全世界每年由于淹溺造成的死亡人數為150萬左右，其中大部分為海水淹溺[1]。在海水淹溺造成的死亡當中，兒童及少年占了很大比重，這與兒童自救意識和能力差有很大關系。盡管政府及醫療機構對防治兒童淹溺做了大量的宣傳，但兒童每年淹溺的人數仍居高不下。在海水淹溺發生后，呼吸及心跳驟停是引起患兒死亡的重要原因，而多數因自救或他救存活下來的患兒會伴隨較為嚴重的急性肺損傷[2-3]。大量關于海水吸入性肺損傷的研究表明，肺組織中難以清除的水腫液是引起機體缺氧、呼吸困難甚至后期肺組織結構改變的重要因素。

研究表明，海水吸入肺組織后，由于肺泡腔內瞬間達到高滲的狀態，液體會從血管及組織細胞中轉移至肺泡腔內[4-5]。機體后續水腫液的清除主要通過肺泡上皮細胞表面的離子通道及水通道蛋白發揮作用[6]。離子通道方面，肺泡腔一側的Na+離子通道會將肺泡腔中的Na+離子轉運至細胞內，位于細胞基底部的Na+-K+-ATP酶會以主動轉運的方式將細胞內高濃度的Na+離子轉運至間質及血液中[7]；而肺泡腔內的水分則是伴隨著Na+離子濃度梯度的改變一起轉運至間質及血液中。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是轉運水分子的專用蛋白通道，研究表明在肺泡細胞中發揮重要作用的蛋白是AQP1和AQP5[8]。在肺泡腔出現水腫液后，位于肺泡細胞表面的水通道蛋白會將水分轉運至細胞內，然后再由基底部的水通道蛋白轉運至血液或間質中。之前關于海水吸入性肺損傷成年動物模型中，海水刺激后Na+-K+-ATP酶及AQP1、AQP5的表達和活性都受到了不同程度的抑制，從而影響了肺水腫的清除，但幼年動物模型中在該方面的改變尚不清楚。

1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2VitD3]在鈣離子代謝中有至關重要的作用，除此之外，還具有多種方面的功效[9]。在小鼠脂多糖導致的急性肺損傷模型中，1,25-二羥維生素D3有減輕肺組織水腫及炎癥細胞浸潤的作用[10-11]。在海水吸入性肺損傷中，1,25-二羥維生素D3也具有抑制炎癥因子表達和減輕水腫的作用，但其在幼年海水吸入性肺損傷動物模型中對肺水腫的作用及機制尚不清楚。本研究通過構建幼鼠海水吸入性肺損傷模型，探究了1,25-二羥維生素D3在幼鼠海水吸入性肺損傷中對肺組織水腫的作用，并檢測了與Na+-K+-ATP酶及水通道蛋白的關系。此外，地塞米松作為臨床上公認的治療各類急性肺損傷的藥物，對海水吸入性肺損傷的治療同樣有著顯著的效果，因此本研究中將地塞米松作為治療效果對照。

1材料與方法

1.1藥品及試劑

實驗中所用1,25-二羥維生素D3和地塞米松試劑均購自Sigma公司，其中1,25-二羥維生素D3用10%甲醇-1‰Triton X-100溶液配制成的混懸液通過灌胃方式進行給藥，地塞米松用5‰羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液也通過灌胃給藥。實驗用配方海水(中國海洋局提供)成分包含：NaCl 26.518g/L，MgSO43.305g/L，MgCl22.447g/L，CaCl21.141g/L，NaHCO30.202g/L，KCl 0.725g/L，NaBr 0.083g/L；pH 8.2，相對密度1.05，滲透壓1 300mmol/L。β-actin、Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5抗體均購于Cell Signaling Technology( CST)公司。實驗中其他試劑和藥物均為國產或進口分析純。

1.2實驗動物及分組

本研究自2016年7月開始，2017年7月終止。21日齡SD(Sprague-Dawley)幼鼠(雄性、44～61g)，由空軍軍醫大學(第四軍醫大學)實驗動物中心提供。海水刺激對肺組織濕干比(W/D)、通透性及離子通道改變的研究分組為：海水刺激0h、1h、4h、6h組。1,25-二羥維生素D3對濕干比、通透性及離子通道蛋白的影響部分實驗分組為：A空白對照組，B海水吸入6h組，C海水吸入6h+VitD3預處理組，D海水吸入6h+地塞米松預處理組。造模前1h給各組幼鼠通過灌胃的方式給藥，A和B組：生理鹽水；C組：25μg/kg VitD3；D組：10mg/kg地塞米松。幼鼠海水吸入性肺損傷模型的制備：首先幼鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1.5mL/kg)進行麻醉，仰臥固定后，頸部正中切口暴露氣管，用1mL的注射器插入氣管，在4min之內緩慢滴注3mL/kg海水。

1.3實驗方法

1.3.1幼鼠肺組織濕干比檢測方法

造模完成后取每只幼鼠右側肺組織，快速擦干肺表面后立即稱量即為肺組織濕重，然后將各組肺組織置于70°C烘箱中烘干，72h后進行稱重即為干重，用濕重除以干重即為各只實驗動物的濕干比。

1.3.2伊文思藍法檢測海水刺激后幼鼠肺組織通透性

造模完成后，將20mg/kg伊文思藍溶液通過尾靜脈注射到實驗動物體內，然后迅速處死幼鼠并取出幼鼠心臟和肺組織，將生理鹽水注入右心室，反復沖洗幼鼠肺組織，直到左心房流出液轉為清亮。然后，將肺組織在烘箱中60°C下烘干，72h后進行稱重并放入甲酰胺中(3mL每100mg組織)，充分溶解后將上清液離心30min，用分光光度計在620nm波長下檢測，通過比對伊文思藍標準曲線得出各樣本中伊文思藍濃度(μg/g組織)。

1.3.3 Western blot法檢測Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白的表達情況

首先各組幼鼠取等量的左側肺組織，加入RIPA裂解液并在冰上進行組織勻漿，離心后收集含有蛋白的上清液，BSA標準曲線法定量，沸水煮15min，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜并用脫脂奶粉封閉；加入一抗(1:1 000稀釋)，4°C過夜，加入羊抗兔二抗(1:5 000稀釋)，37°C孵育1h，ECL顯色并照相，圖像做灰度掃描處理。

1.4統計學方法

2結果

2.1海水刺激后幼鼠肺組織濕干比和伊文思藍通透性的改變

海水刺激后，肺組織濕干比和通透性明顯增加(均P<0.001)；且在刺激1h后達到高峰，其后隨著時間的延長，濕干比和通透性改變略有下降，見圖1、表1、表2。

注：伊文思藍(Evans blue)。

表2不同組間幼鼠肺組織濕干比和伊文思藍通透性的檢測結果對比

Table 2 Comparison of W/D ratio and Evans blue permeability test results among different groups of young rats

注：A為空白對照組，B為海水1h組，C為海水4h組，D為海水6h組，***為與空白對照組比較P<0.001。

圖1幼鼠肺組織濕干比和伊文思藍通透性的檢測結果

Fig.1 W/D ratio and Evans blue permeability in lung tissues of young rats

2.2 1,25-二羥維生素D3對海水刺激后幼鼠肺組織濕干比和通透性的影響

海水刺激6h后，肺組織濕干比和通透性均出現了顯著的增加(均P<0.001)；而VitD3和地塞米松的預處理能夠明顯降低了濕干比和通透性的改變，且VitD3預處理組效果稍好于地塞米松預處理組，見表3、表4、圖2。

損傷指標ABCDW/D3.13±0.335.45±0.454.20±0.374.50±0.45Evans blue21.00±4.5577.00±8.2053.00±6.9857.00±6.98

表4不同組間幼鼠肺組織濕干比和伊文思藍通透性檢測結果對比

Table 4 Comparison of W/D ratio and Evans blue permeability test results among different groups of young rats

注：A為空白對照組，B為海水6h組，C為海水6h+VitD3預處理組，D為海水6h+地塞米松預處理組；***為與空白對照組比較P<0.001，##為與海水6h組比較P<0.01，#為與海水6h組比較P<0.05。

圖2幼鼠肺組織濕干比和伊文思藍通透性結果

Fig.2 W/D ratio and Evans blue permeability in lung tissues of young rats

2.3海水刺激后幼鼠肺組織中Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達的改變

海水刺激后幼鼠肺組織中Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達隨刺激時間的延長逐漸減少，見表5、表6、圖3。

表6不同組間幼鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達檢測結果對比

Table 6 Comparison of expressions of Na+-K+- ATPase, AQP1 and AQP5 in lung tissues among different groups of young rats

注：A為空白對照組，B為海水1h組，C為海水4h組，D為海水6h組；***為與空白對照組比較P<0.001。

圖3幼鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達檢測結果

Fig.3 Expressions of Na+-K+-ATPase, AQP1 and AQP5 in lung tissues of young rats

2.4 1,25-二羥維生素D3對海水刺激后幼鼠肺組織中Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達的影響

海水刺激6h后，幼鼠肺組織中Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達出現了顯著的下降(均P<0.001)；而VitD3和地塞米松的預處理能夠明顯提升Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達，且VitD3預處理組效果稍好于地塞米松預處理組，見表7、表8、圖4。

表8不同組間幼鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達檢測結果對比

Table 8 Comparison of expressions of Na+-K+-ATPase, AQP1 and AQP5 in lung tissues among different groups of young rats

注：A為空白對照組，B為海水6h組，C為海水6h+VitD3預處理組，D為海水6h+地塞米松預處理組；***為與空白對照組比較P<0.001，###為海水6h組比較P<0.001，##為海水6h組比較P<0.01，#為海水6h組比較P<0.05。

圖4幼鼠肺組織Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達檢測結果

Fig.4 Expressions of Na+-K+-ATPase, AQP1 and AQP5 in lung tissues of young rats

3討論

本研究中檢測了1,25-二羥維生素D3對幼鼠海水吸入性肺損傷中肺組織水腫的影響。海水刺激后，幼鼠肺組織濕干比、伊文思藍通透性同時出現了顯著的增加，而1,25-二羥維生素D3的預處理則能夠顯著減輕肺組織濕干比和通透性的改變，即減輕了肺水腫的發生。此外，Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達的改變參與了幼鼠海水吸入性肺損傷中肺組織水腫的發生和發展。在海水刺激后，Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白表達出現了不同程度的減少，影響了對肺泡腔內水腫液的吸收。而1,25-二羥維生素D3的預處理則能夠顯著促進Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白的表達。

3.1海水刺激對肺組織中Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5表達的影響

海水淹溺是導致兒童意外性死亡的重要原因之一，而淹溺后存活下來的患兒往往都伴隨著急性肺損傷的發生，肺水腫是海水吸入性肺損傷最主要的病理改變，因此，減輕肺水腫對于治療患兒的肺損傷尤為重要[12]。之前關于肺水腫的相關研究中發現，離子通道和水通道蛋白在水腫液的吸收中發揮了重要的作用[7-8]。一方面，肺泡腔一側的Na+離子通道會將水腫液中的Na+離子轉運至細胞內，位于細胞基底部的Na+-K+-ATP酶會以主動轉運的方式將細胞內高濃度的Na+離子轉運至間質及血液中，而肺泡腔內的水分則會伴隨著Na+離子濃度梯度的改變一起轉運至間質及血液中。另一方面，在肺泡腔出現水腫液后，位于肺泡細胞表面的水通道蛋白會將水分轉運至細胞內，然后再由基底部的水通道蛋白轉運至血液或間質中。而有研究表明，肺泡細胞中表達的最主要的水通道蛋白為AQP1和AQP5蛋白。本研究中發現海水刺激后肺組織水腫增加的同時，Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白呈現出下降的趨勢，正是因為這些蛋白表達下降，使海水刺激后肺水腫的吸收效率出現下降[8]。

3.2 1,25-二羥維生素D3在減輕海水刺激引起肺組織水腫中的作用機制

1,25-二羥維生素D3是維生素D3的活性成分，在很多方面都有重要作用[13]。在小鼠脂多糖導致的急性肺損傷模型中，1,25-二羥維生素D3有減輕肺組織水腫及炎癥細胞浸潤的作用。在海水吸入性肺損傷中，1,25-二羥維生素D3也具有抑制炎癥因子表達和減輕水腫的作用。本研究中，1,25-二羥維生素D3明顯的減輕了肺組織水腫，同時使Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白的表達出現了回調。正是因為上調了這些蛋白的表達，才使得藥物增加了肺水腫的清除效率。這些結果證實了1,25-二羥維生素D3減輕幼鼠海水肺損傷中肺組織水腫是通過上調Na+-K+-ATP酶、AQP1和AQP5蛋白達成的，也為1,25-二羥維生素D3治療幼兒海水吸入性肺損傷提供了基礎和依據。