黃芪多糖對5-氟尿嘧啶誘導心肌損傷的干預作用研究

吳東垣，劉 煒，李雙斌，崔 燕，祝金明

(1.吉林市中心醫院，吉林 吉林132011；2.吉林大學第二醫院；3.吉林大學中日聯誼醫院)

5-氟尿嘧啶(5-FU)被廣泛用于治療乳腺癌、婦科和胃腸癌癥[1]，可以抑制胸苷的活性，在細胞周期的S期抑制DNA的合成[1，2]，也能抑制RNA合成和加工[3]。5-FU的副作用主要包括白細胞減少、口腔炎、心臟毒性和消化系統癥狀[4,5]。5-FU的心臟毒性給患者帶來嚴重威脅[6]。有研究表明，氧化應激產生反應性氧化物(ROS)是化療藥物產生心臟毒性的主要機制[7，8]，這將導致心肌細胞肥大、凋亡、心室重構等，進一步導致心力衰竭[9]。黃芪多糖(APS)是黃芪的主要成分，在心肌缺血的治療中有顯著效果[10]，可改善冠脈血流量，降低過氧化脂質含量，增加超氧化物歧化酶(SOD)活性，從而保護心臟[11-13]。然而，APS是否可以改善5-FU誘導的心臟毒性仍然未知。本研究旨在探討APS是否可以緩解氧化應激，抑制5-FU誘導的心肌損傷。

1 材料與方法

1.1 心肌細胞培養

取出大鼠心臟后，用Ⅱ型膠原酶(Worthington)溶液消化。消化2 h后，收集心肌細胞。

1.2 動物實驗

8周齡雄性SD大鼠，隨機分為3組，灌胃飼養7天：第1組：生理鹽水組；第2組：5-FU(1 mg/kg體重)；第3組：5-FU+ APS(1.5 g/kg體重)。在此之后，切除心臟并提取蛋白質。

1.3 細胞增殖測定

心肌細胞在1%明膠包被的96孔組織培養板中以5000個細胞/孔的密度培養。 24 h后，5-FU溶解在DMSO中，以1 nM、10 nM、100 nM和1 mM的最終濃度加入培養基中。DMSO加入作為陰性對照。MTT試劑以0.5 mg/ml的終濃度加入每個孔，在37℃溫育5 h。然后，除去培養基，每孔加入100 μl DMSO溶解結晶。使用微板讀數器測定每孔570 nm下的吸光度。此外，將細胞用100 nM 5-FU預培育12、24、48和72 h，并以相同的方法測定細胞生存力。每個實驗獨立進行至少3次。

1.4 活性氧檢測

細胞在六孔細胞培養板上培養，24 h后，以1 nM、10 nM、100 nM和1 mM終濃度的5-FU處理細胞。48 h后，收集心肌細胞，離心，在PBS中洗滌3次(5 min/次)。然后將載玻片用5 μM DHE(Vigorous Biotechnology Beijing Co.,Ltd)在無血清的DMEM F-12培養基中37℃黑暗處理30 min。將細胞在4%多聚甲醛中室溫下固定30 min。將載玻片用冷PBS洗滌3次并置于顯微鏡下。免疫熒光圖像通過熒光顯微鏡捕獲。用流式細胞儀(BD公司)分析相對熒光強度，檢測心肌細胞內ROS含量。

1.5 Western blot分析

用細胞裂解緩沖液(Cell Signaling Technology公司)裂解細胞并收集總裂解物，使用BCA蛋白質(Millipore，Billerica，MA，USA)測定蛋白濃度。等量蛋白用12%的SDS-PAGE分離，并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore，Billerica，MA，USA)。將膜用5%(重量/體積)脫脂奶粉在室溫下孵育2 h。該膜與一抗兔抗人eNOS和Bcl-2、Bax和GAPDH(細胞信號)一起溫育。抗體根據制造商的說明，在5%牛血清白蛋白稀釋。然后加入辣根過氧化物酶綴合的二抗，并使用化學發光儀(ECL，Amersham Biosciences公司)通過放射自顯影檢測所產生的信號。GAPDH作為內參。

1.6 酶活性測定

組織勻漿以2 000 rpm/min離心10 min。根據制造商的說明,使用檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京，中國)測定總蛋白、SOD、過氧化氫酶(CAT)和MDA的含量。

1.7 統計學方法

數據被表示為平均值±標準誤(mean±SEM)表示。采用SPSS10.0軟件進行統計評估。統計比較采用單因素方差分析(ANOVA)進行，并采用Dunn’s方法以鑒別組間差異。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5-FU顯著增強心肌細胞ROS的產生

5-FU預處理顯著增強心肌ROS的產生，并呈現劑量依賴性(圖1)。

圖1 5-FU顯著增強原代心肌細胞ROS的產生，并呈現劑量依賴性

2.2 5-FU降低原代心肌細胞活力，呈劑量和時間依賴性

MTT法用來研究5-FU對細胞活力的影響。如圖2A，5-FU孵育的心肌細胞在100 nM和1 mM濃度時，細胞活力顯著降低。同時，用100 nM 5-FU處理的心肌細胞，細胞活力在48 h和72 h分別下降了34.5%和42.3%(圖2B)。

(A)5-FU 100 nM和1 mM顯著降降低心肌細胞活力。(B)心肌細胞用100 nM 5-FU處理后48 h和72 h，細胞活力分別減少34.5%和42.3%。數據代表平均值±SEM，n=3獨立試驗。*與對照組相比，P<0.05，**與對照組相比，P<0.01。

圖25-FU降低心肌細胞活力，呈現劑量和時間依賴性。

2.3 5-FU在體內誘導心臟毒性和細胞凋亡

在體外研究中發現與5-FU顯著增強半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活化(圖3A)。同時，凋亡抑制基因Bcl-2蛋白水平顯著降低，而凋亡基因Bax蛋白

水平顯著增強(圖3A)。在心肌細胞用100 nM 5-FU處理時，我們還檢測了SOD和丙二醛(MDA)含量。該數據表明，5-FU顯著降低SOD的含量而提高MDA水平，這表明5-FU具有心臟毒性作用(圖3B和3C)。

(A)5-FU顯著增強caspase 3活性。(B)5-FU降低超氧化物歧化酶(SOD)的含量。(C)5-FU增強MDA的水平。數據代表平均值±SEM，n= 3獨立試驗。*與對照組相比，P<0.05，**與對照相比，P<0.01。

圖35-FU體內誘導心臟毒性和細胞凋亡

2.4 黃芪多糖通過調節活性氧的產生抑制5-FU誘發的心肌損傷

APS預孵育可以顯著逆轉SOD下降，降低MDA含量(圖4A)。 Western blot分析表明，APS治療可以降低5-FU誘導的caspase3的激活和Bax蛋白在體內的表達水平。對比單獨5-FU處理組，APS治療可以上調Bcl2蛋白的表達水平(圖4B)。

3 討論

心臟損傷是化療藥物的嚴重副作用之一，顯著限制了其臨床應用[14]。明確化療藥物心臟毒性的發生機制，可以降低化療藥物對正常組織的不良影響，改善腫瘤治療效果，具有重要意義。

5-FU已經廣泛應用于癌癥治療[15，16]。據報道，心臟毒性的發生率極高，范圍從20%至100%[17，18]。本研究中，對5-FU產生心臟毒性的具體機制進行了探討，從而為制定預防心臟毒性的策略提供了有效參考。本研究中，我們使用不同濃度的5-FU處理心肌細胞，發現它可以顯著提高ROS水平。此外，MTT結果顯示，5-FU處理可以降低心肌細胞活力并呈現劑量和時間依賴性，而且5-FU明顯增強caspase 3活性。更重要的是5-FU可以降低SOD含量并增加MDA含量。這些體外實驗表明，5-FU能誘導大鼠心肌細胞損傷。

(A)APS預孵育顯著提高SOD的水平，降低MDA含量。(B)APS降低5-FU誘導的caspase3激活和Bax的表達。數據代表平均值±SEM，n=3獨立試驗。*與對照組相比，P<0.05，**與對照相比，P<0.01。

圖4黃芪多糖APS可通過調節ROS生成，改善5-FU引起的心臟損傷

黃芪多糖是具有悠久應用歷史的傳統中藥，可增強機體免疫力，降低癌癥細胞的生長并能減輕炎癥反應[19]。已有研究表明，APS是一種有效的保護性藥劑，可以改善心臟損傷，例如可以抑制心肌肥大、改善心力衰竭[20]。在人類和動物心臟衰竭模型中，心肌氧化應激均可導致心室明顯擴張[21，22]。ROS通常是由心肌細胞在化療藥物作用下釋放[23]。我們確定了ROS由5-FU以劑量依賴性方式誘導產生。

在本研究中，我們發現，黃芪多糖主要通過緩解氧化應激而抑制5-FU誘導的心肌細胞凋亡。因此，我們的研究為防治5-FU引起的心肌損傷提供了新的方法。