人臍帶間充質干細胞上清液對大鼠肝星狀細胞生長的影響

汪文穎,郝利銘，尹 菲，黃可欣，姜文華

(吉林大學基礎醫學院 組胚教研室，吉林 長春130021)

隨著國內外對干細胞研究的深入和技術的發展，間充質干細胞(mensenchymal stem cells,MSCs)因其來源豐富,取材方便、容易,免疫原性低,具有多向分化的潛能成為治療肝纖維化的研究熱點[1,2]。肝纖維化是慢性肝損傷的終末期，肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)激活后分泌大量膠原蛋白，造成細胞外基質的過度沉積而導致的肝損傷在肝纖維化的發展過程中起著關鍵作用。據相關研究[3,4]MSCs上清液含有干細胞分泌的相關因子[5]，可以作為MSCs移植[6-8]的替代療法。本文利用臍帶來源的MSCs研究其上清液對大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

見表1。

表1 實驗細胞、試劑的來源

1.2 方法

1.2.1人臍帶間充質干細胞( human umbilical cord mensenchymal stem cells,hUCMSCs)的純化、擴增、凍存和復蘇

臍帶來源于吉林大學白求恩第一醫院健康足月分娩的新生兒。本研究通過吉林大學倫理委員會審批，家屬均簽署知情同意書。按文獻報道的方法[9]采用組織塊貼壁法獲得hUCMSCs，采用10%FBS+DMEM+雙抗培養液在37℃，5%CO2條件下常規培養，0.25% 胰酶消化傳代培養以純化。凍存：消化細胞制備單細胞懸液， 1 000 rpm×3 min中 離心,棄上清，置于10%DMSO+20%FBS+DMEM 的凍存液中,直接放入順序降溫盒中，隔天放入液氮罐凍存。復蘇：從液氮罐中取出凍存管，迅速移入37℃水浴鍋輕輕搖動使其融化，移入離心管中添加適量PBS混勻,1 000 rpm×3min 離心，棄上清，添加5 ml培養液混勻，置于培養瓶中常規培養。并鑒定凍存、復蘇對hUCMSCs的形態的影響。

1.2.2hUCMSCs上清液的提取

取第3、4 代hUCMSCs,計數2.4×105cell/5ml培養液/瓶,常規培養，培養3天后，收集液體，0.22 μm濾膜過濾后，2 000 rpm×5 min 低溫離心，收集上清，-80℃保存。

1.2.3HSC-T6 細胞培養、傳代、凍存及復蘇

HSC-T6細胞培養在10%FBS+1%雙抗+89%DMEM-H的培養液中，于37℃，5%CO2條件下常規培養。待細胞達到80%融合時，取對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。 凍存和復蘇方法同1.2.1。

1.2.4實驗分組

實驗取對數生長期HSC-T6細胞接種于培養板中，24 h后分為3 組，分別為對照組(10%FBS+1%雙抗+89%DMEM-H)、25%hUCMSCs 上清液組(10%FBS+1%雙抗+25%hUCMSCs上清液+64%DMEM-H)、50%hUCMSCs 上清液組(10%FBS+1%雙抗+50%hUCMSCs上清液+39%DMEM-H)。

1.2.5hUCMSCs上清液對HSC-T6細胞形態的影響

將HSC-T6按2×104細胞/1 ml/孔，接種于24孔板中，按1.2.4中的實驗分組，分別于培養0 h、24 h、48 h后，顯微鏡下觀察其生長狀態和形態變化。

1.2.6MTT檢測hUCMSCs上清液對HSC-T6細胞增殖的影響

HSC-T6以4×104細胞/ml，每孔100 μl接種于96 孔板中。按2.4中的分組，設置4 個板，每組設6 復孔，分別用于檢測細胞貼壁后培養12 h,24 h,36 h,48 h 的細胞增殖情況。 在達到培養時間前4 h進行MTT 檢測。每孔加入5 g/L 的MTT 溶液20 μl，作用4 h后棄上清。每孔加入DMSO 溶液150 μl，溶解形成的甲臜結晶。作用10-20 min后，在分光光度計490 nm 波長下檢測吸光值。以A490 下的吸光度值代表細胞的相對數量，反映細胞增殖情況。

1.2.7Annexin V-FITC/PI 雙染檢測hUCMSCs上清液對HSC-T6凋亡的影響

將HSC-T6按2×104細胞/1 ml/孔，接種于24孔板中，按1.2.4中的實驗分組，培養48 h。

(1)各組細胞用不含EDTA 的胰酶消化后，300 g，4℃離心5 min 收集細胞。

(2)用預冷的PBS 洗滌細胞2 次，每次均需300 g，4℃離心5 min。收集1-5×105細胞。

(3)加入100 μl 1×Binding Buffer 重懸細胞。

(4)加入5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI Staining Solution，輕輕混勻。

(5)避光、室溫反應10 min。

(6)加入400 μl 1×Binding Buffer，混勻。

(7)滴1滴用Annexin V-FITC/PI 雙染的細胞懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC 熒光信號呈綠色，PI 熒光信號呈紅色。

1.2.8免疫細胞化學檢測hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞TGF-β1、α-SMA 表達的影響

HSC-T6以2×105細胞/ml/每孔接種于帶有細胞載玻片的24孔板中，按1.2.4中分組情況，培養48 h后，取出載玻片，采用免疫組化SP染色方法，按說明書要求操作,進行TGF-β1、α-SMA抗體染色，TGF-β1的一抗稀釋為1∶600、α-SMA的一抗稀釋為1∶800，DAB顯色。染色完成后顯微鏡下觀察并分析TGF-β1、α-SMA的陽性表達情況。

1.2.9統計學分析

采用SPSS19.0 軟件計算每組數據的均值和方差，所得結果均采用平均值±標準差(means±SD)表示，采用t檢驗進行統計學分析，當P<0.05時表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 組織塊貼壁法培養hUCMSCs 細胞的形態

組織塊貼壁后1周可見散在、貼壁生長的細胞集落。原代細胞培養需10-14 d,傳代后在3-5 d細胞需再次傳代,細胞低密度時長成扁平單層細胞,細胞生長密度增加趨于融合時,細胞形態變得細長,形態類似成纖維細胞,呈平行排列生長或旋渦狀生長，凍存復蘇后細胞形態和生長狀況穩定(圖1)。按照課題組已發表的論文鑒定為MSCs[10,11]。

2.2 hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞形態的影響

對照組HSC-T6細胞貼壁生長、呈星形或多邊形伸展狀態，胞內含大量顆粒；隨著培養時間的延長，細胞數量明顯增加。(見圖2 A1、 A2、A3)；25%hUCMSCs上清液組HSC-T6細胞，隨著培養時間的延長，細胞突起減少，細胞數目減少(見圖2 B1、B2、B3)；50%hUCMSCs上清液組在24 h、48 h與0 h對比發現細胞形態更加不規則，細胞體積減小、突起減少明顯，細胞數量明顯減少 (見圖2 C1、C2、C3)。

2.3 hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞增殖的影響

MTT結果分析顯示(表1)，12 h時3組細胞數量無明顯差異(P>0.05)。培養24 h后，25% hUCMSCs上清液組、50% hUCMSCs上清液組HSC-T6 細胞的增殖受到抑制，與對照組相比，均差異顯著(P<0.05)；培養36 h后,25% hUCMSCs上清液組、50% hUCMSCs上清液組與對照組相比，HSC-T6 細胞的增殖明顯受到抑制，差異顯著(P<0.05)；培養48 h后，25%hUCMSCs上清液組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，50%hUCMSCs上清液組和對照組相比差異性極其顯著(P<0.001)，25%hUCMSCs上清液組和50%hUCMSCs上清液組相比差異性極其顯著(P<0.001)。

A：傳代培養24 h的 hUCMSCs B:傳代培養48 h的hUCMSCsC：傳代培養72 h 的hUCMSCs D:復蘇后培養96 h的hUCMSCs

A1、A2、A3分別為對照組0 h、24 h、48 h；B1、B2、B3分別為25% hUCMSCs上清液組0 h、24 h、48 h；C1、C2、C3分別為50% hUCMSCs上清液組0 h、24 h、48 h

圖2 hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞形態的影響

*:與對照組比較P<0.05;**:與對照組比較P<0.01;***:與對照組比較P<0.001；#：與25% hUCMSCs上清液組比較P<0.05；△：與25% hUCMSCs上清液組比較P<0.001。

2.4 hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI 雙染顯示綠色、紅色熒光的細胞分別為早期、晚期凋亡細胞。對照組HSC-T6 細胞綠色熒光、紅色熒光的細胞較少(圖3 A、B、C)。 25%hUCMSCs上清液組、50%hUCMSCs上清液組凋亡的細胞數量均增多(圖3D、E、F、 G、H、I)，凋亡細胞百分率與對照組相比，均明顯增加(圖3J)，差異顯著(P<0.01)。

A、B、C 為對照組；D、E、F為25% hUCMSCs上清液組；G、H、I為50% hUCMSCs上清液組 J為3組凋亡細胞百分率對比圖**：與對照組相比P<0.01

圖3AnnexinV-FITC/PI雙染檢測hUCMSCs上清液對HSC-T6細胞凋亡的影響

2.5 hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞中TGF-β1、α-SMA 表達的影響

TGF-β1和α-SMA的陽性表達均表達在HSC-T6 細胞胞漿內，DAB顯為黃色。25%hUCMSCs上清液組(見圖4B)、50%hUCMSCs上清液組(見圖4C)和對照組(見圖4A)相比，25%hUCMSCs上清液組TGF-β1的陽性表達減少，但無顯著性差異(P>0.05)， 50%hUCMSCs上清液組TGF-β1的陽性表達明顯減少，差異顯著(P<0.05)(見圖4H)； 25%hUCMSCs上清液組(圖4E)、50%hUCMSCs上清液組(圖4F)和對照組(圖4D)相比，25%hUCMSCs上清液組α-SMA的陽性表達減少，但無顯著性差異(P>0.05)，50%hUCMSCs上清液組α-SMA的陽性表達明顯明顯減少，差異顯著(P<0.05)(見圖4H)。

A為對照組TGF-β1;B為25%hUCMSCs上清液組TGF-β1;C為50%hUCMSCs上清液組TGF-β1 D為對照組α-SMA;E為25%hUCMSCs上清液組α-SMA;F為25%hUCMSCs上清液組α-SMA;H為3組平均光密度對比圖*:與對照組比較P<0.05

圖4hUCMSCs上清液對HSC-T6細胞中TGF-β1、α-SMA表達的影響

3 討論

肝纖維化[12，13]是由各種致病因素引起肝細胞變性、壞死，導致炎癥反應，刺激纖維組織異常增生而形成的病理過程，我國是世界上慢性肝病發病率最高的地區之一，目前慢性肝病的治療缺乏有效措施，因而急需研究和探索新的肝病治療技術[14，15]。

目前研究表明，肝纖維化過程是可逆的[16，17]，肝星狀細胞的異常激活并導致細胞外基質在肝內過量積聚是肝纖維化發生的中心環節[18，19]。抑制肝星狀細胞的增殖或促進其凋亡,抑制其分泌細胞外基質或促進細胞外基質降解，是阻止或逆轉肝纖維化進程的關鍵[20-22]。

本研究通過組織塊貼壁法獲得的細胞，經形態學、表面抗原、分化能力等鑒定為間充質干細胞，可常規凍存、復蘇。通過hUCMSCs上清液與HSC-T6共培養的方法檢測hUCMSCs上清液對HSC-T6細胞的影響，MTT結果表明，hUCMSCs上清抑制HSC-T6的增殖，且與hUCMSCs上清液的濃度與時間成正比。Annexin V-FITC/PI 雙染方法檢測表明，hUCMSCs上清液促進HSC-T6 細胞凋亡，且hUCMSCs上清的濃度越高，HSC-T6 細胞凋亡比率越高。這表明，hUCMSCs上清液可明顯抑制HSC-T6 細胞的生長。

在此過程中，hUCMSCs上清液是否可抑制肝星狀細胞的激活？α-SMA是肝星狀細胞活化的標志蛋白，為此，本研究檢測了HSC-T6 細胞α-SMA的表達。免疫組化結果顯示，50%hUCMSCs組α-SMA 的表達明顯降低，這表明，hUCMSCs上清液可抑制HSC-T6 細胞的活化。

TGF-β1是炎癥條件下誘導肝星狀細胞活化的重要信號分子,TGF-β1激活后，能夠快速與肝星狀細胞表面的受體相結合，導致肝星狀細胞激活，在TGF-β1持續刺激下造成細胞外基質(如膠原纖維)的大量合成[12],形成肝纖維化。hUCMSCs上清液抑制肝星狀細胞活化的作用機制是否與其能抑制TGF-β1的表達相關？為此，本研究檢測了hUCMSCs上清液對HSC-T6 細胞TGF-β1表達的影響。免疫組化結果顯示，50%hUCMSCs上清液組HSC-T6 細胞TGF-β1的表達較對照組明顯降低，這表明，hUCMSCs上清液可明顯抑制HSC-T6 細胞TGF-β1的表達。

上述結果表明，一方面，hUCMSCs上清液能夠抑制HSC-T6 細胞的生長、促進其凋亡，使活化的肝星狀細胞數量下降；另一方面，hUCMSCs上清液能夠抑制TGF-β1在活化的肝星狀細胞的表達，則抑制了TGF-β1 與肝星狀細胞表面的受體相結合，導致活化的肝星狀細胞合成細胞外基質的能力下降。hUCMSCs上清液通過上述兩方面的作用，抑制了HSC-T6細胞的生長。