Th9和Th22細胞及其細胞因子在兒童支氣管哮喘發病中的作用

李 志，冷 峰，楊婷婷，李文哲，王 波，薛邦祿

(1.大連市中心醫院 檢驗科,遼寧 大連116033；2.大連醫科大學基礎醫學院, 遼寧 大連116044)

支氣管哮喘(bronchial asthma)是一種兒童常見的變態反應性疾病，發病率多年來一直保持著上升。最新流行病學統計顯示，支氣管哮喘患兒發病率逐年升高，總發病率與10年前相較升高了43.4%，與20年前相較升高了147.9%[1,2]。由于小兒支氣管哮喘的病理過程非常復雜，尚無十分明確的發病機制，最常見的是由IgE作為媒介傳導而產生的氣道變態性反應，除此之外還和神經、免疫、內分泌環境、精神和遺傳學等因素密切相關。

在傳統的變態反應型支氣管哮喘中，機體免疫調節功能異常為哮喘發作的主要因素，Th1/Th2細胞之間的平衡失調導致的Th2細胞占據主要地位被認為是最為經典[3]。除了傳統上的CD4+初始T細胞亞群：Th1、Th2、Treg和Th17等細胞外，近年來，多種新型CD4+T細胞亞群的發現進一步完善了Th1/Th2平衡失調理論。國內外學者通過大量研究從而發現多種輔助性T細胞均參與兒童支氣管哮喘的病理過程并在其中扮演著重要角色。CD4+初始T細胞在IL-4與TGF-β共同存在的情況下能夠產生一種IL-9+IL-10+Foxp3-的T細胞，即Th9細胞。Th9細胞主要分泌的IL-9在支氣管哮喘的呼吸道炎癥中能夠提高IgE的分泌量，促進氣道高反應性的發生，在細胞的分化、增殖、細胞間信息傳達等方面都存在重要調節意義。Th22細胞是一種和Th17、Th9等細胞都不同的獨立Th細胞，不同的炎癥介質和Th22細胞的配體依賴轉錄因子AHR能夠調節CD4+T細胞亞群對IL-22的表達。IL-22可以增強呼吸道修復上皮功能，縮小哮喘患者炎癥范圍，從而保護肺部組織、減輕支氣管炎癥。

本研究主要通過檢測支氣管哮喘患兒的外周血Th9和Th22細胞的比例以及血清中IL-9、IL-22和總IgE的表達，并分析這些細胞及其細胞因子與哮喘嚴重程度之間的關系，進一步的討論Th9和Th22細胞在哮喘臨床診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取2016年1月至2017年3月在大連市中心醫院就醫的哮喘患兒56例，依據哮喘患兒發病的嚴重程度分為兩組：哮喘發作組和哮喘緩解組。哮喘的診斷均符合2016年中華醫學會兒科學分會呼吸學組修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》診斷標準[4]。其中，哮喘發作組共32例，男15例，女17例，年齡3-14歲，平均(6.65±2.57)歲；哮喘緩解組共24例，男9例，女15例，年齡3-12歲，平均(5.49±2.18)歲。另選20例健康兒童作為健康對照組，其中男12例，女8例，年齡3-12歲，平均(5.9±2.31)歲。所有兒童一個月內均未使用糖皮質激素及其他免疫抑制劑，經檢查排除患有肺部疾病的可能并排除合并腎小球腎炎及鼻炎、蕁麻疹等變態反應性疾病史和其他相關慢性疾病。三組對象在一般臨床資料方面均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1主要試劑

FITC標記-抗人CD4單克隆抗體、IntraPrepTM固定劑和破膜劑購自美國Beckman公司；PE標記-抗人IL-9抗體、PE標記-抗人IL-22抗體及同型對照IgG1-PE購自美國Affymetrix e-Bioscience公司；淋巴細胞分離液、RPMI-1640培養基、佛波醇酯類多克隆刺激劑(PMA)、鈣離子載體離子霉素(Ionomycin)、蛋白轉運阻抑劑莫能霉素(monensin)購自美國Sigma-Aldrich公司；人IL-9和IL-22 ELISA定量試劑盒購自美國R&D公司。

1.2.2主要儀器設備

流式細胞儀：CytomicsTMFC 500；特定蛋白分析儀：IMMAGE 800，購自美國Beckman公司。Sunrise酶標儀：購自奧地利Tecan公司。

1.3 標本采集和處理

采集受檢者清晨空腹靜脈血各3 ml于EDTA抗凝管和促凝管中，所有標本均來自于臨床診斷所用標本，無乳糜或溶血現象。

1.3.1分離單個核細胞(PBMCs) 在無菌離心管中加入適量的人淋巴細胞分離液，將磷酸鹽緩沖液(PBS)與抗凝血1∶1混合稀釋，沿管壁緩慢加于分離液上。經2 000 r/min離心20 min后，用毛細吸管從中間吸取單個核細胞，置入事先準備好的離心管中。

1.3.2分離血清 待促凝管中血液凝固后，經3 000 r/min離心5 min，取上層血清分為兩份，一份送至檢驗科免疫室檢測血清總IgE的含量，另一份置于-70℃冰箱冷凍保存用于ELISA試驗檢測細胞因子IL-9和IL-22的含量。

1.4 實驗方法

1.4.1Th9和Th22細胞的流式檢測

(1) 重懸細胞：在分離出的PBMCs中加入PBS，經1 500 r/min離心10 min，洗滌細胞兩次。末次洗滌后，棄上清，重懸于RPMI-1640培養液中(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素)。

(2) 胞外染色：根據單抗試劑說明，在收集的細胞內加入CD4-FITC單抗，混勻后避光孵育20 min。

(3) 細胞培養：將染色后的PBMCs懸液加入24孔培養板內培養，每孔1 mL，培養孔中加入終濃度為50 μg/L PMA、離子霉素1 μg/mL、3 μmol/L莫能霉素的混合液。將細胞濃度調整至1×106/mL，置入37℃的5%二氧化碳培養箱孵育。4 h后取1 ml細胞懸液至流式管中，2 000 r/min離心8 min，棄上清，PBS洗2次。

(4) 固定破膜：洗滌后的細胞懸液用試劑IntraPrepTM進行固定和破膜。加固定劑500 μl，振蕩后避光孵育15 min，加PBS離心洗滌，棄上清，加破膜劑500 μl，輕輕混勻，避光孵育5 min。

(5) 胞內染色：將破膜后的懸液經PBS洗滌2次后平均分成4管，分別加入IL-9-PE、IL-22-PE和同型對照IgG1-PE各10 μl，避光孵育30 min，PBS洗滌2次后加入500 μl的PBS重懸。

(6) 流式檢測：應用CytomicsTM FC 500流式細胞儀檢測標記的各淋巴細胞胞膜及細胞因子的熒光強度，界定CD4+IL-9+為Th9細胞，CD4+IL-22+為Th22細胞。

1.4.2特定蛋白分析儀檢測血清中總IgE的含量

分離出的血清采用IMMAGE 800特定蛋白分析儀以及相應的配套原裝試劑進行上機檢測總IgE含量。

1.4.3ELISA檢測血清中IL-9和IL-22的含量

嚴格按照各ELISA試劑盒操作說明進行操作。在450 nm波長下，用酶標儀測定實驗血清中細胞因子IL-9和IL-22及各標準品的OD值，計算出血清中IL-9和IL-22濃度。

1.5 數據處理

用流式細胞儀所測得的Th9和Th22細胞所占細胞百分比以及用ELISA試劑盒所測得的血清中IL-9和IL-22的濃度，均采用SPSS 22.0系統軟件進行統計學分析，數據以“x—±s”表示，兩組間數據采用獨立樣本t檢驗；采用Pearson檢驗進行直線相關性分析。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 支氣管哮喘患兒外周血中Th9和Th22細胞的表達

哮喘發作組患兒外周血中Th9和Th22細胞表達比例與哮喘緩解組、健康對照組相比顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。哮喘緩解組患兒外周血中Th9和Th22細胞表達比例與健康對照組相比顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組兒童外周血中Th17、Th9和Th22細胞表達比例

注：a：與哮喘緩解組、健康對照組相比，P<0.05；b：與健康對照組相比，P<0.05

2.2 支氣管哮喘患兒血清中IL-9、IL-22和總IgE的水平

哮喘發作組患兒血清中IL-9、IL-22和總IgE的水平與哮喘緩解組、健康對照組相比顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。哮喘緩解組血清中IL-9、IL-22和總IgE的水平與健康對照組相比顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組兒童血清中IL-17、IL-9、IL-22和總IgE的含量

注：a：與哮喘緩解組、健康對照組相比，P<0.05；b：與健康對照組相比，P<0.05

2.3 支氣管哮喘患兒血清中IL-9、IL-22與總IgE水平相關性分析

在哮喘發作組中，支氣管哮喘患兒血清中IL-9、IL-22與總IgE水平均呈正相關(r=0.491，r=0.786，P值均<0.05)。見圖1、圖2。

圖1 支氣管哮喘患兒血清中IL-9與總IgE水平呈正相關

圖2 支氣管哮喘患兒血清中IL-22與總IgE水平呈正相關

3 討論

兒童支氣管哮喘是一種由于機體免疫調節功能紊亂導致的慢性氣道炎癥。兒童由于免疫系統發育受限，CD4+T細胞各亞群的表達也和成年人有所不同。既往認為Th1細胞是支氣管哮喘的保護因素，在眾多哮喘病理機制中Th1/Th2細胞平衡失調導致的Th2細胞占主要地位被認為是最為經典的。但研究發現該失衡理論與實驗結果有出入，阻斷Th2類細胞因子并不能有效的緩解哮喘，因此不能完全解釋支氣管哮喘的病理機制[5]。支氣管哮喘主要是由IgE作為媒介傳導的氣道過敏性反應，IgE的水平變化與支氣管哮喘的誘發以及輕重程度有很大的關系。國外研究調查顯示，在支氣管哮喘的發病過程中，59%左右的哮喘為中性粒細胞型，而僅有41%的哮喘為嗜酸粒細胞型，兒童哮喘大多為中性粒細胞型[6]。

一直以來，IL-9一直被看做是Th2細胞分泌的相關因子，直至2008年Th9細胞以一種獨立新型CD4+T細胞的身份被發現。雖然Th2細胞也可以分泌IL-9但分泌量遠不及Th9細胞多。人類Th9細胞與鼠類不同，主要表達IL-9，而并不表達IL-10[7]。IL-9對淋巴B細胞有直接作用，能夠共同與IL-4調控IgE合成；誘導中性粒細胞增殖，從而釋放IL-8通過正反饋調節來招募更多中性粒細胞；促使肥大細胞增殖，產生炎癥介質[8]。有研究發現，IL-9可增強骨髓祖細胞對IL-5受體α鏈的表達能力，同時調節一些趨化因子Eotaxin等來促進嗜酸粒細胞前體在肺部的的分化、成熟和聚集，參與哮喘發病[9]。本次研究結果顯示，哮喘發作組及哮喘緩解組外周血Th9及相關細胞因子IL-9的水平與健康對照組相比均顯著升高，支氣管哮喘患兒血清中IL-9與總IgE水平之間呈正相關，這與黃璇[10]等人的結果相一致。這提示了Th9及細胞因子IL-9與支氣管哮喘患兒疾病嚴重程度之間呈正相關，這可以作為哮喘活動期的一種重要標志。國外學者通過評估阻斷IL-9對慢性氣道炎癥的影響發現，抗IL-9抗體可以減少由于慢性氣道炎癥和氣道重塑導致的細胞浸潤[11]?？笽L-9抗體可以減少Th17細胞、Th9細胞、中性粒細胞、嗜酸粒細胞以及肥大細胞的數量并抑制細胞因子的合成和分泌，減少IgE在淋巴B細胞中的合成，這為今后兒童支氣管哮喘的醫治提供了新途徑。

不同于Th17、Th9等細胞Th22細胞是一種以分泌IL-22為主的的新型CD4+T細胞。不同的炎癥介質和Th22細胞的配體依賴轉錄因子AHR能夠調節CD4+T細胞亞群對IL-22的表達。TNF-α，IL-6和活性維生素D都被認為能夠增強Th22細胞對IL-22的表達[12]。在氣道嗜酸性炎癥中，IL-22可以與TNF-α一同誘導信號轉導抑制肺上皮細胞產生IL-25，改變樹突狀細胞的功能并來抑制氣道過敏性炎癥反應[13]。與此同時，研究發現[14]，不同研究者對于IL-22在哮喘中的作用持有“促炎”和“抑炎”兩種不同的觀點：有學者在小鼠的哮喘模型中發現，經OVA致敏、激發后，IL-22敲除后小鼠與野生型相比氣道過敏性反應明顯增強、氣道的反應性增高；但也有學者經研究后認為，在慢性中重度哮喘患兒外周血中IL-22 mRNA表達明顯升高，與此同時其含量與血清總IgE水平之間呈正相關。張旃[15]等通過臨床研究發現，IL-22在哮喘中究竟發揮的“促炎”還是“抑炎”作用取決于其表達的階段和組織微環境：在氣道平滑肌細胞的分化成熟過程中濃度的高低具有決定性的意義，細胞在高濃度的IL-22存在下增殖能夠被顯著抑制，而在低濃度的時候則恰恰相反；對于氣道成纖維細胞來說，在哮喘后續階段，IL-22的效果微乎其微。對于人氣道的上皮細胞，IL-22有雙重影響：在哮喘發生的啟動階段，氣道上皮細胞在IL-22的作用下能夠加速壞死進程，從而達到抑制分化增殖、促進氣道炎癥的目的；但在后續階段IL-22則可能具有保護組織的作用[16]。本研究顯示，與哮喘緩解組、健康對照組相比，哮喘發作患兒體內Th22及其相關細胞因子IL-22的分泌明顯升高，血清中IL-22與總IgE水平之間呈正相關，這和施靈敏[17]等人的研究結果相符。提示Th22及相關細胞因子IL-22參與了哮喘的發病過程并與哮喘患兒疾病嚴重程度相關。

綜上所述，支氣管哮喘患兒外周血中Th9和Th22及其相關細胞因子是小兒支氣管哮喘的發病過程中的重要角色，為高級免疫干預治療提供了新可能性。臨床上可以通過檢測哮喘患兒體內細胞因子水平變化并結合哮喘患兒的臨床表現來進行病情的評估，進而可以探討能否使用細胞因子相關的拮抗劑或者調控劑來輔佐治療兒童哮喘，為哮喘患兒的初期診斷和初期治療提供科學的手段。