基于變性梯度凝膠電泳和MiSeq高通量測序技術分析恩施地區臘肉的細菌多樣性

董 蘊，王玉榮，王 堯，廖 華，趙慧君，郭 壯,3,*

（1.湖北文理學院食品科學技術學院，鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市農業局，湖北 恩施 445000；3.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

臘肉主要是以鮮豬肉或冷凍豬肉為原料，添加食鹽等腌制后經烘烤、晾曬或熏制而成的傳統非即食性發酵肉制品，我國湖北、湖南、四川、云南、廣東和黑龍江等多地區一直以來均有制作和食用臘肉的習慣[1-2]。在臘肉的整個發酵與貯藏過程中，微生物與臘肉中的蛋白質和脂肪等營養物質的反應不僅賦予臘肉色澤鮮明、風味獨特的品質，同時也有可能使成品受到雜菌污染[3-4]。因此，采用合適的技術對臘肉制品中的微生物種類及多樣性進行解析是極為必要的。

劉曉蓉等[5]采用純培養手段從自然發酵臘肉中分離出28 株菌株，經鑒定其中有4 株隸屬于乳酸桿菌屬；劉書亮等[6]采用分離純化和生理生化鑒定相結合的方法從12 份傳統腌臘肉制品中分離出戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）等菌株；陳競適等[7]以湘西臘肉為研究對象，采用稀釋平板計數法對其微生物結構進行解析，發現酵母菌、霉菌和微球菌是其主要微生物群落；馮秀娟等[8]以湖南傳統臘肉為原料，采用傳統微生物學方法對發酵過程中微生物的生長情況進行研究，發現乳酸菌和葡萄球菌為其中的優勢菌；王海燕等[9]采用傾注平板和平板劃線法從傳統湖南臘肉中分離出289 株葡萄球菌；李福榮等[10]采用純培養手段對信陽傳統發酵臘肉中的細菌進行研究，發現其優勢細菌為葡萄球菌和微球菌。以上研究均采用以純培養技術為基礎的傳統微生物學手段對臘肉中的微生物進行分析，發掘了大量的微生物菌種資源，但該方法具有一定的局限性，不能鑒定出不可培養的微生物，不能全面、準確地反映樣品的微生物信息[11]。變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術能夠應用于食品中微生物群落結構的研究，具有操作簡單易行、靈敏度高、可檢測到1 個核苷酸水平的差異等特點[12]，目前在豬肉[13]、鴨肉[14-15]和雞肉[16]冷藏過程中的微生物多樣性變化及發酵肉制品[17]和屠宰場廢水[18]的微生物多樣性解析中有著廣泛的應用。較之DGGE技術，MiSeq高通量測序技術具有通量高、能夠實現樣品間平行分析的優點[19]，目前在肉制品發酵用菌株基因組測序[20-21]、雞肉制品[22]和火腿腸[23]腐敗微生物鑒定及食用肉制品對腸道菌群多樣性的影響方面[24]有著廣泛的應用。DGGE和MiSeq高通量測序技術相結合，亦應用于牛肉等肉制品的細菌多樣性研究中[25]。目前，關于恩施地區臘肉細菌多樣性評價的研究還較少，將DGGE和MiSeq高通量測序技術相結合，用于臘肉制品微生物多樣性解析的研究也較少。

本研究采用免培養、結果直觀可靠的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE技術與MiSeq高通量測序技術相結合的方法對采集自恩施地區農家自制臘肉的細菌多樣性進行解析，以期為該地區臘肉品質的保障及微生物菌種資源發掘提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臘肉：湖北省恩施土家苗族自治州農家自制，5 份樣品分別編號為LR1、LR2、LR3、LR4和LR5。

聚丙烯酰胺、尿素、N,N-亞甲基二丙烯酰胺、過硫酸銨、冰醋酸、甲醛和硝酸銀（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒 德國Qiagen公司；5×FastPfu Buffer、10×PCR Buffer、dNTPs Mix、DNA聚合酶（5 U/μL）、pMD18-T載體 寶生物工程（大連）有限公司；6×Loading buffer、DL2000、DL15000 DNA Marker 寶日醫生物技術（北京）有限公司；2×PCR mix 南京諾唯贊生物科技有限公司；DGGE擴增引物ALL-GC-V3F（5’-CGCC CGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACC GGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）/ALL-V3R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）和高通量測序引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）/806R（5’-GGACTACHVGGGT-3’） 武漢天一輝遠生物科技有限公司；Axygen清潔試劑盒 北京科博匯智生物科技發展有限公司；大腸桿菌（E. coli）Top10 本實驗室保藏。

1.2 儀器與設備

HBM-400B拍擊式無菌均質器 天津市恒奧科技發展有限公司；5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度計美國Nano Drop公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀 美國AB公司；PowerPacTMBasic穩壓儀、DCodeTMSystem、UVPCDS 8000凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司；MiSeq PE300高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理及宏基因組DNA提取

參照GB/T 4789.17—2003《食品衛生微生物檢驗 肉與肉制品檢驗》進行取樣，加入滅菌水225 mL混勻后300 r/min條件下離心10 min，取上清液；然后將上清液在10 000 r/min條件下離心10 min，保留沉淀[26]。按照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒使用說明中的方法提取樣品總DNA，并用微量紫外分光光度計檢測其濃度和純度。

1.3.2 細菌PCR-DGGE指紋圖譜分析

以提取的DNA為模板進行PCR擴增，擴增體系及反應參數參照文獻[27]中的方法并略作改動：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP mix（2.5 mmol/L）4 μL、ALL-GCV3F（10 μmol/L）和ALL-V3R（10 μmol/L）各1 μL、rTaq酶（5 U/μL）0.4 μL、DNA模板1 μL，用無菌水將體系補齊至50 μL，混合均勻后置于PCR儀中94 ℃預變性5 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸90 s，循環30 次；然后72 ℃完全延伸10 min，擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。取10 μL擴增產物，置于質量分數8%的聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺體積比37.5∶1）（變性劑范圍35%～52%）中進行檢測，電泳條件為：0.5×TAE緩沖溶液，恒溫60 ℃，120 V運行78 min后80 V維持13 h。電泳結束后將銀染法染色的凝膠掃描成像，挑選優勢條帶切膠回收，然后使用不帶GC夾子的引物進行擴增，清潔，連接pMD18-T載體并轉化大腸桿菌Top10，挑選2 株單菌落進行陽性克隆鑒定，并將菌液送至測序公司測序[28]。序列置于NCBI數據庫進行同源性比對。

1.3.3 細菌MiSeq高通量測序分析

參照沈馨等[29]的方法進行PCR擴增。20 μL體系：5×FastPfu Buffer 4 μL、dNTP mix（2.5 mmol/L）2 μL、引物338F（5 μmol/L）和806R（5 μmol/L）各0.8 μL、rTaq（5 U/μL）0.4 μL、DNA模板10 ng，剩余體積用無菌水補齊；反應參數為：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、45 s；30 次循環；72 ℃、10 min。擴增合格的產物寄往上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。序列下機后需進行拼接和質量控制，參照郭壯等[30]的方法刪除不合格序列后，再根據各序列標簽將序列劃分至各樣本中。利用QIIME數據分析平臺[31]劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），再從每個OTU中挑選代表序列，于Greengenes[32]和RDP（Ribosomal Database Project）[33]數據庫中進行比對，確定其微生物分類水平，并計算各樣品α多樣性。

1.4 數據處理

DGGE條帶序列使用BioEdit 7.0.9軟件（美國Tom Hall公司）進行拼接和引物切除，然后將處理好的序列置于NCBI數據庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對；使用OriginPro 2017軟件（美國OriginLab公司）繪圖。

2 結果與分析

2.1 臘肉樣品細菌的PCR-DGGE分析

圖1 臘肉樣品中細菌的DGGE分析結果Fig.1 DGGE fingerprint of bacteria in Chinese bacon samples

由圖1可知，經DGGE后不同樣品泳道中出現數量、亮度不一的條帶，從中共挑選出9 條優勢條帶，其中條帶7、8為所有樣品的共有條帶，條帶1、2、3、5為部分樣品共有條帶，而條帶4、6分別為樣品LR2和LR3的特有條帶。

表1 臘肉樣品細菌DGGE優勢條帶的比對分析結果Table 1 Sequence alignment of domain DGGE bands of Chinese bacon samples

由表1可知，各優勢條帶與其近源種的相似度均在99%以上。經比對，條帶2、4和8分別為馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）和香料葡萄球菌（Staphylococcus condimenti），均隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus）；條帶1和6分別為北極冷桿菌（Psychrobacter arcticus）和糞嗜冷桿菌（Psychrobacter faecalis），均隸屬于嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）；條帶3和5分別為植物乳桿菌阿根廷亞種（Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis）和食淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylovorus），均隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）；條帶7為食鹿角菜假交替單胞菌（Pseudoalteromonas carrageenovora），隸屬于假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）。結合圖1分析可知，臘肉中的細菌主要為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），且樣品中均含有香料葡萄球菌（Staphylococcus condimenti）和食鹿角菜假交替單胞菌（Pseudoalteromonas carrageenovora），而樣品LR2和LR3中的特有細菌分別為小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）和糞嗜冷桿菌（Psychrobacter faecalis）。全拓等[34]的研究結果與本研究相同，他們通過采用純培養的方法對川渝兩地臘肉的優勢菌多樣性進行解析發現，葡萄球菌是臘肉產品貨架期內的優勢菌。

2.2 臘肉樣品細菌的MiSeq高通量測序分析

采用MiSeq高通量測序技術從5 個樣品中檢測到的序列在100%相似度下可劃分為103 157 條，在97%的相似度下又可將這些序列劃分至8 876 個OTU中，從各OTU中挑選代表性序列，與數據庫進行比對可判定其微生物學分類定位。

表2 樣品序列微生物分類地位統計Table 2 Number of identifiable units at different taxonomical levels

由表2可知，不同樣本中檢測到的細菌條帶數量有所差異。經比對，樣品中各微生物分類水平數量亦不相同，樣品LR4中條帶數量和OTU最多，而樣品LR3中微生物的門、綱、目、科、屬各級數量均較其他樣品多。采用α多樣性分析發現，在條帶數量為33 210 條時，超Ⅰ指數和香農指數最大的為樣品LR4，最小的為LR1，說明樣品LR4中細菌總數及豐富度最高，而LR1中最低，這與DGGE分析結果一致。進一步在門水平分析樣品中的細菌信息。

圖2 臘肉樣品細菌門水平的平均相對含量分析Fig.2 Comparative analysis of the average relative contents of bacterial phyla in Chinese bacon samples

由圖2可知，從5 個臘肉樣品中檢測出硬壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、梭桿菌門（Fusobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）6 個細菌門，其中平均相對含量大于1.0%的為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），且二者的累積平均相對含量高達99.11%。異常球菌-棲熱菌門為樣品LR3的特有細菌門，平均相對含量僅為0.60%；梭桿菌門為樣品LR4中的特有細菌門，平均相對含量僅為0.41%。

圖3 臘肉樣品中優勢細菌屬的平均相對含量分析Fig.3 Comparative analysis of the average relative contents of dominant bacterial genera in Chinese bacon samples

進一步對99 個細菌屬中平均相對含量大于1.0%的細菌屬進行分析。由圖3可知，臘肉中平均相對含量大于1.0%的細菌屬分別為葡萄球菌屬（Staphylococcus，40.18%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter，24.02%）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas，9.37%）、環絲菌屬（Brochothrix，8.53%）、科貝特氏菌屬（Cobetia，4.71%）和不動細菌屬（Acinetobacter，2.31%），僅有5.54%的序列不能鑒定到屬水平。采用MiSeq高通量測序技術亦檢測出乳酸菌屬（Lactobacillus），其平均相對含量為0.27%，但PCR-DGGE未檢測出隸屬于科貝特氏菌屬（Cobetia）和不動細菌屬（Acinetobacter）等菌屬的細菌，這可能與其擴增所用引物或這些菌屬的豐度等因素有關。

圖4 臘肉樣品中OTU出現次數的統計分析Fig.4 Distribution of OTU as a function of their prevalence in Chinese bacon samples

表2表明不同樣品中OTU數量亦不相同。由圖4可知：僅出現1 次的OTU，即樣品中特有OTU占總OTU數的80.26%，其所包含的序列有16 520 條，占總序列數的7.36%；出現5 次的OTU，即5 個樣品中共有的OTU僅占OTU總數的2.84%，但其所包含的序列有166 546 條，占OTU總數的74.22%，說明臘肉樣品細菌菌群中部分為某些樣品中特有的，但數量較少，含量最多的主要為共有菌群。

圖5 臘肉樣品中核心優勢OTU的相對含量分析Fig.5 Comparative analysis of the relative contents of the dominant core bacterial OTUs

將樣品中共有且相對含量大于1.0%的OTU定義為核心優勢OTU。由圖5可知，臘肉中核心優勢OTU有16個，其中OTU5583、OTU5308、OTU8865、OTU7670、OTU1632、OTU2776、OTU1595、OTU367、OTU5460和OTU1519隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），OTU687、OTU3304、OTU5538和OTU8970隸屬于嗜冷桿菌屬（Psychrobacter），OTU4150和OTU514分別隸屬于和環絲菌屬（Brochothrix）。由此可見，臘肉樣品中含有大量核心優勢細菌菌群，且主要為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）和環絲菌屬（Brochothrix）。

3 結 論

采用PCR-DGGE和MiSeq高通量測序技術相結合的方法對恩施地區臘肉細菌多樣性進行解析。PCR-DGGE結果表明，臘肉中的細菌主要為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），且樣品中均含有香料葡萄球菌（Staphylococcus condimenti）和食鹿角菜假交替單胞菌（Pseudoalteromonas carrageenovora）；MiSeq高通量測序技術結果表明，臘肉中平均相對含量大于1.0%的細菌屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、環絲菌屬（Brochothrix）、科貝特氏菌屬（Cobetia）和不動細菌屬（Acinetobacter）。由此可見，2 種技術均表明恩施地區臘肉中的優勢細菌為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）。