表面等離子體共振技術測定豬肉中磺胺二甲嘧啶

俞 婧，范素芳,*，李 強，馬俊美，石偉杰，孟志娟，張 騰，張 巖,*

（1.河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091；2.北京中龍益誠科技有限公司，北京 100071）

磺胺類藥物是一類具有對氨基苯磺酰胺的藥物總稱[1]，具有抗菌譜廣、穩定性強等優點，廣泛應用于畜牧業和獸醫臨床治療[2-3]。磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，SM2）具有抗菌力強、毒性小等優點，是畜牧養殖中應用最為廣泛的磺胺類藥物之一[4]。磺胺類藥物的毒性較高，而且半衰期比較長[5]，長期食用被磺胺類藥物污染的水和食物，人體會產生耐藥性并能引發過敏反應[6]。磺胺類藥物的殘留情況日益受到關注，許多國家和地區制定了磺胺類藥物的最大殘留限量[7]。國際食品法典委員會和歐美許多國家規定動物組織中磺胺類藥物的殘留總量不能超過100 μg/kg[8]，日本規定不能超過20 μg/kg[9]，我國農業部第235號公告規定，牛乳中SM2的最大殘留限量為25 μg/kg，動物源食品中磺胺類藥物總量的最大殘留限量為100 μg/kg[2,10-11]。

目前，磺胺類藥物的檢測方法主要有液相色譜法[4-5,7,12]、液相色譜-串聯質譜法[1-3,10]、液相色譜-高分辨質譜法[8-9]等傳統的儀器分析法和酶聯免疫法[13]、化學發光微粒子免疫法[11]、分子印跡二維光子晶體水凝膠傳感器法[6]等快篩方法。儀器分析方法準確、靈敏，但前處理過程繁瑣、操作專業性強、儀器設備昂貴，不適合基層推廣應用。酶聯免疫法檢測時間較長，且需要二抗標記，底物和硫酸對操作人員有害。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器是一種常用于生物大分子探測與分析的消逝波傳感器，具有靈敏度高、實時性好、無需標記、樣品用量少、樣品制備時間短、便攜等優點[14-15]。SPR已經廣泛應用于醫療診斷和環境監測，如蛋白質、血糖、微生物、氣體檢測[16]、血清中轉鐵蛋白檢測[17]和生物醫學、環境中小分子檢測[18]以及食品安全領域檢測，如牛乳中三聚氰胺和磺胺[19-21]、花生中黃曲霉毒素B1[22]、油品種類[23]、β-興奮劑[24-26]、水樣品中莠去津[27]、肉類中泰樂霉素和磺胺[28-29]、食源性化學危害物檢測等[30]。本研究采用SPR技術，利用競爭免疫反應原理，建立豬肉樣品中SM2的快速篩查方法，為現場抽檢提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SM2標準品（純度≥99%）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司；SM2單克隆抗體和SM2-BSA偶聯物 河北省科學院；實驗用水均為屈臣氏純凈水。

豬肉樣品購自當地超市，用組織粉碎機磨碎后備用。

1.2 儀器與設備

生物芯片、YC-SPR-A1生物分子互作儀 北京中龍益誠科技有限公司；BPX-162恒溫培養箱 上海博迅實業有限公司；3K 15離心機 德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 SM2生物芯片的制備

生物芯片表面修飾有L-半胱氨酸連接的納米金（Aunanoparticles，Au-NP）顆粒。取出Au-NP芯片，用去離子水沖洗，清洗表面，氮吹干燥；取80 μL 1.0 mg/mL的SM2-BSA，滴到Au-NP芯片表面，37 ℃孵育1 h，用去離子水沖洗Au-NP芯片，氮吹干燥；Au-NP芯片表面加3% BSA，封閉未作用位點，避免非特異吸附，芯片用去離子水沖洗后37 ℃孵育1 h；取出芯片，氮氣吹干后待用。

1.3.2 SM2芯片固定抗原濃度及測試液抗體濃度的選擇

在Au-NP芯片表面修飾不同質量濃度的SM2-BSA（0.7、1.0、1.5 mg/mL），按1.3.1節中的步驟制備芯片，配制不同質量濃度（5、10、15、30 μg/mL）抗體標準溶液，對芯片進行測試，綜合考慮標準曲線的線性范圍，選擇最終的抗原質量濃度和抗體質量濃度。

1.3.3 再生條件和進樣條件

分別考察10 mmol/L Gly（甘氨酸）-HCl（pH 2.0～2.5）、50 mmol/L NaOH和100 mmol/L NaOH作為再生液時儀器的響應情況，再生液體積100 μL，流速400 μL/min，用芯片的洗脫結果和再生次數評價再生效果。樣品測定時的進樣體積為200 μL，進樣速率為20 μL/min。每次的樣品測定時間為12.5 min。

1.3.4 樣品前處理

稱取（2.00±0.02） g研磨好的豬肉樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，30 ℃條件下超聲輔助提取20 min，9 500 r/min條件下離心5 min；取5 mL上清液，于50 ℃條件下旋轉蒸發至近干；加入1 mL正己烷復溶樣品，并轉移至5 mL離心管中，加入等體積的0.01mol/L PBS緩沖液，渦旋混勻1 min，9 500 r/min條件下離心5 min；取下層水相，與等體積抗體混合均勻后，待測。

1.3.5 標準曲線的繪制

豬肉樣品基質較復雜，非特異性吸附較多，按照1.3.4節的樣品前處理方法處理空白豬肉樣品，得到空白基質提取液，用該空白基質提取液配制不同質量濃度的SM2標準溶液，將SM2標準溶液與等質量濃度的抗體等體積混合，混合溶液中SM2的最終質量濃度分別為0、6.25、10.00、12.50、25.00 ng/mL。測定時的進樣體積200 μL，進樣流速20 μL/min，讀取各樣品的SPR響應值。

1.3.6 加標回收實驗

在（2.00±0.02） g豬肉中加入質量濃度為10 μg/mL的SM2標準溶液，添加水平分別為10、20、100 μg/kg，每個水平3 個平行。樣品經前處理后，與抗體溶液等體積混合，進樣，測得響應值，通過標準曲線計算實際測得濃度，并計算回收率。

1.4 數據處理

標準曲線制作和數據統計分析采用Microsoft Excel 2010軟件，圖形繪制采用OriginLab 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 SM2芯片固定抗原濃度及測試液抗體濃度的優化結果

由表1可知，雖然當抗體和抗原質量濃度增大時，儀器響應值相應增大，但SM2標準溶液的質量濃度較小時，由于抗體質量濃度過大，梯度不明顯，因此抗體及抗原的質量濃度不宜過大。抗原質量濃度為1.5 mg/mL，分別通入質量濃度為10.0、15.0、30.0 μg/mL的抗體溶液，儀器響應值分別為69.732、81.125、118.326。在抗體質量濃度為30.0 μg/mL時，儀器響應值最大，但考慮到抗體成本問題，選取15.0 μg/mL的抗體作為制作標準曲線時的反應濃度。在3 片芯片上分別修飾1.5、1.0、0.7 mg/mL的SM2-BSA，通入15.0 μg/mL的抗體，儀器響應值分別為82.306、67.325、62.475，可以看出，隨著抗原質量濃度的增大，抗體的反應響應值也有一定程度的增大。

表1 不同質量濃度抗原、抗體條件下的儀器響應值Table 1 Instrumental response at different concentrations of antigen and antibody

芯片固定抗原質量濃度及測試液抗體質量濃度的確定還會影響方法的靈敏度及線性范圍。在抗體質量濃度15.0 μg/mL、抗原質量濃度1.5 mg/mL條件下繪制所得標準曲線方程為y=0.047 0x2-1.099 6x+84.147 0（R2=0.976 8）。SM2標準溶液的質量濃度較小時，響應值區分不明顯，這可能是抗體或抗原過量造成的，于是進一步降低抗體和抗原的質量濃度，把抗體質量濃度降為10.0 μg/mL，抗原質量濃度降為0.7 mg/mL，得到標準曲線方程為y=0.014 7x2-2.263 2x+94.721 0（R2=0.983 6）。當抗體和抗原質量濃度均下降時，小質量濃度SM2標準溶液的響應值可以明顯區分開，這可能是由于芯片的空間位阻效應變小，抗體的結合效率更高。

對表1中的數據分別作不同處理間顯著水平為0.05的成對數據t檢驗，結果表明，抗體質量濃度為15.0 μg/mL、抗原質量濃度為1.5 mg/mL和抗體質量濃度為10.0 μg/mL、抗原質量濃度為0.7 mg/mL時沒有顯著差異，其他處理組之間均存在顯著差異。因此最終選擇抗體質量濃度為10.0 μg/mL，抗原質量濃度為0.7 mg/mL。

2.2 不同再生條件對芯片使用次數的影響

圖1 SPR檢測過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of SPR detection process

由圖1可知，SPR檢測過程分為抗體與芯片表面抗原的結合、解離和再生，以再生后儀器響應值能否回到芯片未結合抗體以前的響應值為判斷標準，評價洗脫是否徹底。再生的目的是破壞SM2-BSA與SM2抗體的非共價結合，當選用條件溫和的Gly-HCl緩沖液（pH 2.0～2.5）時，SM2-BSA與SM2抗體不能徹底分離；使用50 mmol/L NaOH和100 mmol/L NaOH作為再生液時，通過檢測芯片可再生次數與SPR響應值考察2 種再生液的洗脫再生效果，采用最佳抗原、抗體質量濃度。

圖2 再生次數對SM2芯片響應值的影響Fig.2 Effect of regeneration cycles on SM2 chip response

由圖2可知：使用50 mmol/L NaOH作為再生液時，再生次數達到20 次以上時，SM2芯片活性下降較快，儀器響應值明顯降低；而使用100 mmol/L NaOH作為再生液時，再生次數達到45 次時，芯片活性仍較好，儀器重復性良好。因此最終選擇100 mmol/L NaOH作為再生液，在再生液體積100 μL、流速400 μL/min時，芯片可重復使用45 次以上。

2.3 方法的線性范圍和檢出限

抗體質量濃度為10.0 μg/mL、抗原質量濃度為0.7 mg/mL時，標準溶液質量濃度范圍為0～100 μg/L時擬合的線性方程為y=-0.812 5x+81.954 0（R2=0.795 7），SM2質量濃度達到50 ng/mL時儀器響應值超出線性范圍。標準溶液質量濃度范圍為0～25 μg/L時擬合的線性方程為y=-2.185 5x+95.726 0（R2=0.986 6），線性關系良好。最終選擇標準溶液質量濃度線性范圍為0～25 μg/L。

通過多次測定空白樣品的本底值來計算儀器的檢出限，通過空白樣品的本底值計算出的質量濃度水平的標準偏差為σ，3σ對應的質量濃度即為該儀器的檢出限。計算得到儀器的檢出限為2 ng/mL，對應的方法檢出限為4 μg/kg，方法定量限為10 μg/kg，方法的線性范圍為10～50 μg/kg，質量濃度超出線性范圍時需對樣品進行適當稀釋。

2.4 方法的準確度和精密度

由表2可知，方法的回收率范圍為87.6%～107.4%，RSD均小于11.00%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中對不同添加水平回收率的要求。

表2 方法的回收率Table 2 Recoveries of the method

2.5 實際樣品測定

表3 實際樣品測定結果Table 3 Sulfamethazine contents of real samples

從超市和菜市場購買10 份豬肉樣品，分別采用本研究中的方法和GB/T 21316—2007《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-質譜/質譜法》中的液相色譜-質譜/質譜法進行測定。由表3可知，檢測結果均為未檢出，即測定結果低于方法檢出限。用本研究中的方法和GB/T 21316—2007本研究中的方法對理論值為80 μg/kg的質控樣品進行測定，重復測定5 次，質控樣測定結果分別為77.3～80.3 μg/kg和78.9～81.0 μg/kg，說明SPR法與國標方法的測定結果基本一致。

3 結 論

本研究建立了基于SPR技術的豬肉中SM2的測定方法。該方法的線性范圍、準確度和精密度均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中的相關要求。該生物芯片在優化好的條件下可重復使用40 次以上，另外，該方法比較快速，樣品測定時間低于15 min。通過對實際樣品及質控樣品進行測定，并經液相色譜-質譜/質譜法確證，表明該方法可用于豬肉中SM2的快速篩查分析。