瀕危藥用植物金鐵鎖花粉活力快速測(cè)定研究

許銀鳳 尹子麗

摘要：目的 瀕危藥用植物金鐵鎖花粉活力檢測(cè)。方法 采用I2-KI染色法、醋酸洋紅染色法、過氧化物酶沉淀法和TTC染色法。結(jié)果 I2-KI法不能染不上色，不適合檢測(cè)金鐵鎖花粉活力。醋酸洋紅染色法、過氧化物酶沉淀法和TTC法可用于現(xiàn)采金鐵鎖花粉活力的測(cè)定，過氧化物酶沉淀法不能用于貯藏金鐵鎖花粉活力的測(cè)定。無論是現(xiàn)采的花粉還是貯藏花粉，最好的方法是醋酸洋紅染色法。結(jié)論 為金鐵鎖的優(yōu)良種質(zhì)資源保存提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：金鐵鎖;花粉活力;快速測(cè)定

中圖分類號(hào)：R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2018）07-0069-02

Study on Rapid Determination of Pollen Vitality for Endangered Psammosilene Tunicoides

XU Yin-feng YIN Zi-li2

（School of Minorities Medicament，Yunnan Unversity of Traditional Chinese Medicine Kunming 650500;

2. Yunnan Econmy Management College，Kunming 650106）

【Abstract】Objective：To measure the pollen vitality for endangered Psammosilene tunicoides. Methods：I2-KI staining，acetate carmine staining，peroxidase precipitation and TTC staining techniques were used. Results：The I2-KI staining failed to measure the pollen vitality of Psammosilene. Acetate carmine staining，peroxidase precipitation and TTC techniques can be used to determine the pollen viability of fresh Psammosilene. The peroxidase precipitation method cannot be used to determine the pollen viability of stored Psammosilene. The best method was the acetate carmine staining as it was suitable for fresh and stored pollen. Conclusion：This study provides a theoretical basis for optimal preservation of Psammosilene.

【Key words】Psammosilene tunicoides，pollen viability，rapid determination

金鐵鎖（Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu）系石竹科（Caryophyllaceae）單種屬植物，為我國西南特有的藥用植物，是“云南白藥”組成藥材之一，其療效明顯，具有較高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但由于成材時(shí)間較長，且完全依靠自然生長，野生資源逐漸減少，現(xiàn)已作為稀有瀕危物種列于《中國植物紅皮書》中，是國家二級(jí)保護(hù)植物[1]，因而保護(hù)和擴(kuò)大金鐵鎖種質(zhì)資源的研究工作尤為重要。花粉是種子植物的雄配子體，在有性繁殖中發(fā)揮著重要作用，利用花粉進(jìn)行種質(zhì)資源的貯藏保存時(shí)非常重要的手段之一。對(duì)瀕危藥用植物金鐵鎖的花粉進(jìn)行生活力的測(cè)定研究，可為金鐵鎖種質(zhì)資源的保存和遷地保護(hù)提供理論依據(jù)。本文采用I2-KI染色法、醋酸洋紅染色法、過氧化物酶染色法、TTC染色法4種方法對(duì)金鐵鎖花粉活力進(jìn)行測(cè)定，并建立和篩選出準(zhǔn)確、簡便、快速的測(cè)定方法，為金鐵鎖大規(guī)模制種和貯藏花粉提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試花粉 云南白藥集團(tuán)中藥材栽培基地金鐵鎖的花粉。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 I2-KI染色法 植物花粉成熟時(shí)積累有一定的淀粉，通常可以用I2-KI染成藍(lán)色。發(fā)育不良的花粉常呈畸形，不積累淀粉，用I2-KI（0.1%）染色，不呈藍(lán)色，而呈黃褐色。取現(xiàn)采的花粉，置于載波片上，加1-2滴I2-KI溶液，蓋上蓋波片，置于顯微鏡下觀察，低倍鏡下取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)并記錄被染色的花粉數(shù)量。

1.2.2 醋酸洋紅染色法 正常花粉呈圓球形，物質(zhì)積累較多，對(duì)醋酸洋紅的吸附作用和親和力強(qiáng)，通常易被染成深紅色，發(fā)育不良的花粉常呈畸形，不積累物質(zhì)或積累很少，用醋酸洋紅染色呈淡紅色或無色。取花粉，置于載波片上，加1-2滴醋酸洋紅溶液（100 mL45%的醋酸），蓋上蓋波片，置于顯微鏡下觀察，低倍鏡下取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)并記錄被染色的花粉數(shù)量。

1.2.3 過氧化物酶沉淀法 具有生活力的花粉含有活躍的過氧化物酶。此酶能利用過氧化氫使各種多酚及芳香族胺發(fā)生氧化而產(chǎn)生顏色，依據(jù)顏色可知花粉的活性強(qiáng)弱。具體過程為：0.5%聯(lián)苯胺（將0.5 g聯(lián)苯胺溶于100 mL50%乙醇中），0.5%α-萘酚（將0.5 gα-萘酚溶于100 mL50%乙醇中），0.25%碳酸鈉（將0.25 g碳酸鈉溶于100 mL蒸餾水中），實(shí)驗(yàn)前將上述三種溶液各取10 mL混合均勻成試劑Ⅰ。在干凈載波片上放少量花粉，然后加試劑Ⅰ和0.3%過氧化氫各1滴，攪勻后蓋上蓋波片，將制片放置30℃恒溫箱中15 min，置于顯微鏡下觀察，低倍鏡下取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)并記錄被染色的花粉數(shù)量。

1.2.4 TTC染色法 花粉中呼吸酶的活躍情況能較正確地反映其生活力的強(qiáng)弱，同時(shí)氧化還原染料能在呼吸酶的作用下著色。因此可根據(jù)著色情況來判斷花粉的生活力 。在干凈載波片上放少量花粉，然后加1-2滴的TTC溶液（0.5%），蓋上蓋波片，將制片放置35℃恒溫箱中15min，置于顯微鏡下觀察，低倍鏡下取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)并記錄被染色的花粉數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)現(xiàn)采花粉生活力的測(cè)定結(jié)果 由表1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：本研究所采用的4種金鐵鎖花粉活力檢測(cè)方法中，過氧化物酶沉淀法測(cè)得的數(shù)值最高為89.8%，其次為醋酸洋紅染色法為86.7%，I2-KI染色法對(duì)金鐵鎖花粉不能染不上色，因此I2-KI染色法不適合檢測(cè)金鐵鎖花粉活力，I2-KI、醋酸洋紅染色法和過氧化物酶沉淀法均可用于現(xiàn)采花粉生活力的檢測(cè)。不同方法內(nèi)觀察值之間分散程度也有所不同，其中過氧化物酶沉淀法測(cè)定時(shí)各重復(fù)之間的差異很大，標(biāo)準(zhǔn)差為2.8368，TTC染色法次之，醋酸洋紅染色法所得的結(jié)果分散程度最小，標(biāo)準(zhǔn)差為1.8536，同時(shí)醋酸洋紅染色法所測(cè)得的有活力花粉比率平均數(shù)為86.7%，最接近三種方法的平均值（86.87%），所以為獲得準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，對(duì)現(xiàn)采金鐵鎖花粉的生活力檢測(cè)，最好選用醋酸洋紅染色法。

表1 現(xiàn)采金鐵鎖花粉活力測(cè)定結(jié)果

2.2 對(duì)自然風(fēng)干不同時(shí)間的花粉活力的測(cè)定結(jié)果 由表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：醋酸洋紅染色法和TTC染色法對(duì)自然風(fēng)干的金鐵鎖花粉活力測(cè)定均為隨著時(shí)間的延長呈下降趨勢(shì)，TTC染色法下降趨勢(shì)明顯，第1天和第2天差異較大，而在第6 d檢測(cè)到有活力的花粉比率值較低;過氧化物酶沉淀法顯示隨著時(shí)間的延長有活力花粉比率呈上升趨勢(shì)，與實(shí)際不相符合不能用于金鐵鎖花粉活力的測(cè)定。醋酸洋紅染色法所得到的數(shù)據(jù)結(jié)果符合自然干燥貯藏花粉生活力的變化規(guī)律，所以醋酸洋紅染色法可以用來測(cè)定貯藏花粉的生活力。

表2 對(duì)自然風(fēng)干不同時(shí)間的花粉活力的測(cè)定結(jié)果

2.3 低溫（4℃）貯藏條件下的花粉活力的測(cè)定結(jié)果 由表3的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：醋酸洋紅染色法和TTC染色法對(duì)低溫貯藏的金鐵鎖花粉活力測(cè)定均為隨著時(shí)間的延長呈下降趨勢(shì)，TTC染色法在第四天下降趨勢(shì)明顯僅為20.3%;過氧化物酶沉淀法顯示隨著時(shí)間的延長有活力花粉比率規(guī)律不明顯，在1天后呈下降趨勢(shì)，其余均隨著時(shí)間的延長呈上升趨勢(shì)，與實(shí)際不相符合，不能用于金鐵鎖低溫貯藏條件下的花粉生活力檢測(cè)。醋酸洋紅染色法所得到的數(shù)據(jù)結(jié)果符合花粉生活力的變化規(guī)律，所以醋酸洋紅染色法可以用來測(cè)定低溫貯藏金鐵鎖的花粉生活力。

表3 低溫（4℃）貯藏條件下的花粉活力的測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論 4種方法除I2-KI染色法外，其余3種方法可以用于現(xiàn)采金鐵鎖花粉活力的測(cè)定，醋酸洋紅染色法的測(cè)定結(jié)果較精準(zhǔn)。醋酸洋紅染色法和TTC染色法均可用于不同貯藏時(shí)間的花粉生活力測(cè)定，而過氧化物酶沉淀法不適用于貯藏金鐵鎖花粉活力的測(cè)定，為獲得準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果，無論是現(xiàn)采的花粉還是貯藏花粉，最好的方法是醋酸洋紅染色法。

3.2 討論 花粉生活力長短的保持，一方面是由遺傳因素所決定，另一方面也受環(huán)境因素的影響[2]。I2-KI染色法測(cè)定花粉生活力，正常花粉積累淀粉較多，發(fā)育不良的花粉往往不含淀粉或積累淀粉較少，其著色程度由花粉壁的厚薄和花粉內(nèi)支鏈淀粉和直鏈淀粉比例高低決定[3]，可能由于金鐵鎖花粉壁較厚且支鏈淀粉含量較少或無而使I2-KI不能成功對(duì)其花粉染色。過氧化物酶沉淀法主要是靠有活力的花粉含有活躍的過氧化物酶，試劑與此發(fā)生氧化而染色，過氧化物酶沉淀法檢測(cè)金鐵鎖花粉生活力顯示隨著時(shí)間的延長有活力花粉比率呈上升趨勢(shì)，可能因金鐵鎖花粉活力喪失而其過氧化物酶活性沒有消失，所以仍然能染色，也有可能與染色機(jī)理有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

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[2]HC Liu，WQ Jia，XH Du，et al.Study on pollen viability determination and storage of honeysuckle[J].Medicinal Plant，2010，3：31-33，36.

[3]胡晉.花粉的保存和生活力的測(cè)定[J].種子，1990，6：33-35.

（收稿日期：2018-04-17）