對白木香種子黃酮類提取物體外抗氧化能力的研究

邵素珍

摘要：目的 分析體外條件下，白木香種子在抗氧化方面的能力。方法 對白木香的種子進行預處理，并從中提取出黃酮類成分，并采取銅離子還原法來對其抗氧化能力進行測定，并同抗壞血酸（即VC）來對照。測定后計算它的相對總清除率或還原百分率，將相對總清除率或者還原百分率作為縱坐標，將樣品液濃度作為圖的橫坐標來作線性回歸。并通過回歸曲線置信限制，計算其半抑制濃度。結果 在本研究中所得到的數(shù)據(jù)，用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件分析后，得出白木香種子黃酮類提取物對銅離子的還原力的IC50為0.09815 mg/mL。在該考察的總體范圍當中，白木香種子在抗氧化能力方面盡管弱于VC的抗氧化能力，但其卻隨著濃度的升高而增強。結論 中藥白木香種子具備較強抗氧化能力，可以給中藥制劑以及保健品的進一步開發(fā)提供參考依據(jù)，其藥用價值需更進一步的研究。

關鍵詞：白木香種子;體外抗氧化;銅離子還原

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）08-0073-03

所謂白木香種子，即白木香之附屬產(chǎn)物，其盡管具有很高的藥用價值，不過其真正的資源卻未能被人展開有效的開發(fā)和利用。隨著人類各項組織損傷等疾病均同人體內(nèi)部氧化反應有著很大的關聯(lián)，所以，當下已然有越來越多的學者參與到對抗氧化藥物的研究中來。不過，人們對于白木香種子體外抗氧化能力的研究卻較為稀少，有限的研究也僅局限在DPPH法，從而極大的限制了人們對白木香種子抗氧化能力的了解和認識[1]。為了將白木香種子抗氧化的能力進行細致的分析，在本文中，筆者將使用對銅離子的還原能力測定這一體外抗氧化方法來對白木香種子的抗氧化能力及抗菌能力進行研究，以期對白木香種子的開發(fā)和利用帶來一定的啟發(fā)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 白木香種子（茂名市君元沉香種植發(fā)展有限公司提供）;蘆?。╮utin）標準品（北京化學試劑有限公司），鄰苯三酚，F(xiàn)eSO·7H2O;新亞銅：天津市福晨化學試劑廠;鹽酸，過氧化氫，無水乙醇，Tris，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，乙醚等試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 紫外分光光度計（UV-910O，北京瑞利公司），250 mL索氏提取器：鄭州興華玻璃儀器廠電子天平（sartorius BS 110S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），電熱恒溫水浴鍋（DK-98—1型，天津泰斯特儀器有限公司），高速萬能粉碎機（Fw80型，天津泰斯特儀器有限公司）

1.2 方法

1.2.1 提取黃酮類成分 選取1000 g成熟飽滿的白木香種子，并將其放于60度左右的干燥箱中，烘干4 h后，加以研磨至能過60目。稱取200 g的白木香種子粉末，采用無水乙醚為抽提液，80攝氏度條件下，以索氏抽提法將其脫脂及除脂溶性色素。抽提液變?yōu)闆]有顏色時，將石油醚揮盡后在用正丁醇、乙酸乙酯溶液重復前過程。最后，使用體積分數(shù)為60%的乙醇浸提，并回流3次提取黃酮類成分[2]。所有浸提料液的比例為1∶5，每次浸提的時間為2 h，溫度是100度，浸提6次至提取液沒有顏色為止。將所得浸提液合并之后實施減壓濃縮到恒溫后獲取浸膏。

1.2.2 黃酮類成分樣品濃度測定。

1.2.2.1 繪制標準曲線 取蘆丁標準品在120 ℃干燥至恒重后稱取10 mg，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到濃度是100 g/mL的蘆丁溶液。然后將其用70%乙醇進一步稀釋成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL，各取1 mL于試管中，加70%乙醇1 mL，加NaNO2溶液（5%）0.3 mL，搖勻后靜置10 min，然后加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置10 min，再加4%的NaOH溶液2 mL，搖勻后靜置15 min后，510 nm波長處測定吸光度A。然后根據(jù)標準曲線的制作方法，以吸光值（A，510 nm）為縱坐標（y為吸光度），濃度（C，g/mL）為橫坐標（x為白木香種子黃酮類化合物樣品濃度（μg/mL），進行線性回歸并求回歸方程。

1.2.2.2 白木香種子黃酮類化合物樣品含量的測定 分別吸取1 mL樣品于10 mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度。分別取1 mL稀釋液于試管中，加70%乙醇1 mL，依次加入5% NaNO2 0.3 mL，混勻后靜置6 min，加10%Al（NO3）3 0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加4%NaOH溶液2 mL，搖勻后靜置10 min，同時以70%乙醇代替樣品液配制空白試劑。510 nm波長處測定吸光度A。

1.2.3 配置抗氧化研究樣品溶液 稱取10 mg浸膏，將其置于無水乙醇中，配置出1 mg/mL濃度白木香種子的樣品液。

1.2.4 測定還原能力 分別提取濃度不同的5 mL樣品液，并加入7.5 mmol/L的新亞銅試劑及0.01 mmol/L的硫酸銅溶液各1.25 mL，將其混合后再添加ph值為7.0，濃度為0.2 mL每升的NH4Ac溶液，將三樣液體混合至10 mL的體積，然后搖勻取1.0 mL。將該溶液搖勻后放置半個小時后，放置其在450 nm的波長中對其吸光度的數(shù)值進行測量[3]。在這段時間內(nèi)，溶劑作為其空白對照，而VC作為其陽性對照。相對總還原的百分率等于A減去A0再除以Amax減去A0。其中，A0是該樣品的濃度是0時的最大值，Amax是測量一次后所得吸光度值的最大數(shù)，而A則是該樣品的A450nm數(shù)值。

1.3 觀察指標和評價標準 在本次研究中，以氧化劑被阻礙至一半的時候，還原劑（抑制劑）的濃度作為其觀察指標。按上文中所提計算方法展開計算，以相對總還原率作為其縱坐標，樣品液濃度作橫坐標。若一物質(zhì)IC50低于10 mg/mL，則表示擁有抗氧化的能力[4].。

1.4 統(tǒng)計學方法 在本研究中所收獲的實驗數(shù)據(jù)，進行線性回歸及統(tǒng)計分析（一致以SPSS 19.0計學軟件及Microsoft Office2010）。通過可見-紫外分光光度計，將各樣品濃度吸光值讀取出來，測量數(shù)不可以低于3次，并取各次所得數(shù)據(jù)的平均值。通過上文的計算公式計算出相對總清除率和還原率。以相對總清除率（還原率）的百分率作為其縱坐標，以樣品液濃度作為數(shù)據(jù)的橫坐標并作線性回歸，通過線性回歸置信限制，將氧化劑被阻礙至一半時還原劑（抑制劑）的濃度數(shù)值計算出來[5]。

2 結果

2.1 樣品濃度 根據(jù)實驗而得到標準回歸方程y=0.002627x-0.01309（r=0.9992）

測得白木香種子黃酮類提取物樣品吸光度為y=180，由此可得其濃度為x=73.50μg/mL

2.2 對銅離子還原的能力 在濃度為0.02至0.12 mg/mL的范圍之內(nèi)，VC和白木香種子對銅離子還原的能力具有線性關系，通過對回歸線的擬合得到氧化劑被阻礙至一半時還原劑（抑制劑）的濃度數(shù)值分別為0.01725 mg/mL以及0.09815 mg/mL。具體見圖1及圖2。

圖1 白木香種子的銅離子還原能力

注：橫坐標表示白木香種子的濃度（mg/mL），縱坐標表示相對總還原百分率。

圖2 VC的銅離子的還原能力

注：橫坐標表示VC濃度（mg/mL），縱坐標表示相對總還原百分率。

3 討論

從結果上能夠知道，在可以檢測的范圍之內(nèi)，白木香種子在抗氧化方面是隨著本身的濃度升高而增強的。從上述討論得知，白木香種子對銅離子的還原能力的IC50為0.09775 mg/mL，VC對銅離子的還原能力的IC50分別為0.017 mg/mL，從中筆者可以看到，白木香種子相較于VC而言，其抗氧化的能力明顯不如，而國內(nèi)的學者認為，如果某一種藥物的IC50值不高于10 mg/mL，則表示其具備抗氧化的能力[6]。因此筆者可以初步認為，白木香種子具有較為顯著的抗氧化能力。據(jù)學者段周等在對白木香葉提取黃酮類化合物所實施的體外抗氧化能力的研究中，也較為明確的證明了該提取物的清除DPPH·能力[7]。而自由基其實是人類機體所維持生命各種活動的過程中所衍生出來的某一活性分子，如果人體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基，便會致使組織器或者細胞產(chǎn)生損傷，進而引發(fā)各類型的疾病，從而加快人體的衰老速度。而抗氧化劑因為其自身的抗氧化能力，因此可以對自由基的生成產(chǎn)生一定程度的抑制作用，甚至可以將自由基徹底的清除。

所謂白木香，其實就是沉香這味藥材的最重要來源之一。沉香，眾所周知的珍貴藥材。當前，盡管沉香已然在廣東、海南等地開展了大規(guī)模的種植栽培，但我國的沉香需求也正在以一定速度的擴大，因此其往往供不應求。為了生態(tài)的平衡，尋找能有替代沉香的藥物便顯得極為重要[8]。而白木香種子因為其較高的產(chǎn)量以及很實惠的價格，因此，其可以說是代替沉香的首選。在本研究中，筆者通過銅離子還原法這一體外抗氧化方法對白木香種子的抗氧化能力進行了研究和測定，其結果表明，盡管白木香種子在還原銅離子的能力上較VC弱，可是隨著白木香種子濃度的升高，其抗氧化能力也隨之而升高，且其IC50值不高于10 mg/mL，具有較為顯著的抗氧化能力。此可以說是對白木香種子以及精油關于抗氧化能力的探究帶來的一定參考。

上述研究表明明，在抗氧化方面，白木香種子有著很高的能力，此外在筆者研究相關文獻時也發(fā)現(xiàn)，白木香種子種含有各種營養(yǎng)成分以及揮發(fā)油。所以，對白木香種子的研究需要專業(yè)人士作進一步的藥理學分析研究，以期給今后的開發(fā)和利用帶來更為準確的實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2018-05-08）