藍莓組織培養(yǎng)中污染褐變玻璃化的防止措施

于永梅 王冰 余海英

摘要 在藍莓組培過程中很容易產(chǎn)生污染、褐變、玻璃化等現(xiàn)象，這些都直接限制了藍莓規(guī)模化生產(chǎn)。本文總結了藍莓組織培養(yǎng)過程中污染、褐變、玻璃化現(xiàn)象的主要防止措施，以期為藍莓組織培養(yǎng)提供參考。

關鍵詞 藍莓；組織培養(yǎng)；污染；褐變；玻璃化；防止措施

中圖分類號 S633.9 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）10-0105-02

藍莓為多年生小灌木樹種，春季早花，夏季果熟，入秋葉呈紅色，觀賞效果極佳，可作為觀光果園栽培樹種，也可制作盆景；其果實中含有花青素、黃酮等多種多酚類生理活性成分，具有明目、防止腦神經(jīng)衰老、抗癌、抗氧化等多種生理活性功能，越來越受到消費者的青睞，經(jīng)濟價值較高，市場潛力巨大，開發(fā)前景廣闊。藍莓組培育苗技術的研究，采用藍莓組培快繁技術，短期內(nèi)獲得大量的無病毒苗木。探討藍莓苗木的工廠化技術育苗體系，有助于我國藍莓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，滿足社會需求[1-2]。但在藍莓組培過程中，很容易產(chǎn)生污染、褐變、玻璃化等現(xiàn)象，限制了藍莓的組培快繁和大規(guī)模生產(chǎn)，是目前急需解決的關鍵問題。筆者總結了藍莓組織培養(yǎng)繁育中常出現(xiàn)的污染、褐變、玻璃化的防止措施，對藍莓苗木的快速繁殖和推廣具有重要意義。

1 污染

1.1 操作人員注意衛(wèi)生

首先要注意工作人員衛(wèi)生，工作人員進入無菌室不能吃東西、吸煙等，應常剪指甲。工作服要每周清洗消毒1次，夏季要每3 d清洗消毒1次，工作服滅菌后在緩沖室更換；一次性用品要及時更換，口罩、帽子要經(jīng)常清洗。進入無菌室前要用肥皂洗手，進入培養(yǎng)室后再用75%酒精對雙手進行消毒[3]。

1.2 改善接種室環(huán)境條件

接種室應保持密閉、潔凈；培養(yǎng)室應控制空氣相對濕度在70%左右，濕度太高時可用抽濕機除濕。每次接種前均應清潔接種室的地面，并噴75%酒精沉降灰塵，然后打開紫外燈滅菌20～30 min，紫外燈滅菌結束后，用75%酒精擦洗工作臺面。每次接種結束時，應清潔接種室的地面，并定期清洗無菌操作臺的過濾膜和用甲醛熏蒸接種室[4]。

1.3 對培養(yǎng)基及接種工具徹底滅菌

培養(yǎng)瓶在使用之前要徹底清洗，所用的培養(yǎng)基以及接種過程中使用的器具也要嚴格滅菌。一是培養(yǎng)基滅菌。培養(yǎng)基需要在121 ℃條件下滅菌20～30 min，一般滅菌后的培養(yǎng)基不能放置太久，1～2 d內(nèi)用完最好，最長不能超過1周，以減少培養(yǎng)瓶污染。二是接種器具滅菌。將接菌器具用報紙、牛皮紙等包扎嚴密，進行高溫高壓滅菌。由于采用的是高壓濕熱滅菌，外層包裹的報紙易破，故要輕拿輕放。一旦報紙、牛皮紙等破裂，滅菌的工具與空氣接觸，就必須重新滅菌[5]。

1.4 嚴格選擇及消毒外植體

一般情況下選擇在春季晴天中午采集外植體，盡量選擇溫室內(nèi)的植株或新生嫩芽。外植體消毒前先剪掉多余的枝、葉等組織，然后用自來水沖洗表面的灰塵和雜物，大約沖洗30 min。外植體消毒在超凈工作臺上進行，將修剪、沖洗后的外植體放入燒杯中，用洗滌劑水浸泡3 min后，用水沖洗干凈，然后用無菌水沖洗1遍，再用次氯酸鈉或0.1%升汞溶液浸泡10～30 min（視植株品種幼嫩程度而定）消毒，消毒后用無菌水沖洗4～5遍。注意消毒劑對植物有毒害作用，應正確選擇消毒劑的濃度、種類和處理時間，盡量減輕對外植體的傷害。

1.5 合理添加抗生素

在培養(yǎng)基中添加抗生素的主要目的是防止外植體內(nèi)生菌造成的污染，減少培養(yǎng)材料的損失。但是，在使用抗生素時，必須明確使用的抗生素是否會對培養(yǎng)的植物組織有不良影響以及抗生素抑制的病菌種類、使用濃度和處理時間。因為不存在對所有微生物都有效的抗生素，所以在培養(yǎng)基中添加抗生素只能作為防止污染的輔助措施[4]。

2 褐變

2.1 選擇適當?shù)耐庵搀w

不同時期和年齡的外植體在培養(yǎng)中褐變的程度不同。因此，選擇適當?shù)耐庵搀w是克服褐變的重要手段。旺盛生長狀態(tài)的外植體，分生能力較強，其褐變程度低，是組培的首選材料。Danhua和Carole研究了外植體起源與組織褐變的關系，認為腋生枝的頂芽較其他部位枝的頂芽褐變率低，生長在避蔭處的外植體較全光下的褐變率低[5]。

2.2 對外植體進行預處理

預處理可減輕酚類物質對外植體的毒害作用。外植體經(jīng)流水處理后，置于冰箱（5 ℃左右）中12～20 h后，先接種到只添加蔗糖的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7 d，使外植體組織中部分酚類物質滲入培養(yǎng)基，然后取出外植體用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，再接種到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可有效抑制褐變。

2.3 選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基中適宜的無機鹽成分、蔗糖濃度、激素組合、激素水平以及抗褐變劑可減輕褐變現(xiàn)象。通過改良WPM培養(yǎng)基有利于抑制外植體的褐變，通過增加瓊脂用量調(diào)節(jié)培養(yǎng)基硬度，可抑制褐變發(fā)生，瓊脂添加量以8 g/L效果最好。在培養(yǎng)基中加入活性炭和VC液都能一定程度地抑制褐變，促進外植體生長，以活性炭的抑制作用較明顯；當綜合運用VC液與活性炭時，以活性炭濃度為100～200 mg/L時，效果最好[6]。在培養(yǎng)過程中要保持適宜的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)初期保持在15～20 ℃、黑暗或弱光下培養(yǎng)，可減輕培養(yǎng)材料的褐變[7]。在接種1～2 d后，將外植體轉移至新鮮培養(yǎng)基或同一培養(yǎng)基的不同部位，連續(xù)轉移5～6次可防止酚類物質在傷口周圍積累過多，有效防止褐變。

3 玻璃化苗預防措施

3.1 在培養(yǎng)基中適當增加無機營養(yǎng)成分，減少氮素含量

適當增加培養(yǎng)基中鈣、鋅、錳、鉀、鐵、銅、鎂的含量，降低氮和氯的比例，特別是降低銨態(tài)氮濃度，提高硝態(tài)氮濃度，可減少玻璃化苗的比例[8]。

3.2 適當提高培養(yǎng)基中瓊脂和蔗糖的濃度

適當提高培養(yǎng)基中瓊脂的濃度，可以有效克服藍莓組培苗玻璃化。但若瓊脂濃度過大，會導致培養(yǎng)基過硬，影響?zhàn)B分吸收，造成組培苗生長不良。因此，培養(yǎng)基中瓊脂的濃度以8 g/L較適宜。蔗糖的用量對藍莓組培苗玻璃化現(xiàn)象也有一定影響，綜合考慮組培苗的長勢、節(jié)約成本和減少污染等方面，蔗糖用量以25 g/L為宜[9]。

3.3 適當降低細胞分裂素的濃度

在藍莓組織培養(yǎng)中，組培苗玻璃化程度隨著培養(yǎng)基中ZT含量的提高而增加，降低ZT含量，玻璃化苗率顯著降低。但培養(yǎng)基中ZT濃度過低會不利于組培苗的生長分化，ZT 濃度以2 mg/L較適宜[9]。

3.4 增加自然光照，控制光照時間

將玻璃化苗放在自然光下幾天后，莖葉變紅，玻璃化逐漸消失。但是光照時間不宜太長，以8～12 h為宜；光照強度為1 000～1 800 lx時就能滿足藍莓的生長發(fā)育要求，并能有效防止玻璃化[8]。

4 參考文獻

[1] 于強波，蘇丹，于立杰，等.藍莓組培育苗技術[J].北方園藝，2010（9）：163-163.

[2] 范兆和.界藍莓生產(chǎn)歷史與發(fā)展趨勢[J].落葉果樹，2003（1）：50-52.

[3] 任目瑾，周建峰.植物組織培養(yǎng)的常見污染及其防控技術[J].陜西林業(yè)科技，2016（6）：103-105.

[4] 陳玉生，梁秋月，洪向平.植物組織培養(yǎng)污染防治措施[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2008（1）：28-29.

[5] 賈鵬博，姜秀煜，高方.藍莓組織培養(yǎng)污染分析及防治[J].內(nèi)蒙古林業(yè)調(diào)查設計，2011（6）：118-119.

[6] 鄭理喬，黃成林，劉華，等.兔眼藍莓組織培養(yǎng)過程中褐化與生根問題的探討[J].安徽農(nóng)業(yè)大學學報，2012，39（5）：777-782.

[7] 陳惠娟.植物組織培養(yǎng)中褐變的產(chǎn)生機理及克服措施[J].植物保護，2005，31（2）：79-82.

[8] 陳世昌.植物組織培養(yǎng)[M].北京：高等教育出版社，2015：89-93.

[9] 畢云，蘇艷，張藝萍，等.藍莓組織培養(yǎng)過程中玻璃化現(xiàn)象的防止技術研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2014，27 （6）：2539-2542.