HPLC-ELSD法區分小兒氨酚黃那敏顆粒中體外培育牛黃和人工牛黃

程歲寒 張雙慶 馬 燦 張 彥

(1. 安琪酵母股份有限公司 湖北省酵母功能重點實驗室， 湖北 宜昌 443003； 2. 三峽大學 生物與制藥學院， 湖北 宜昌 443002；3. 中國疾病預防控制中心營養與健康所，北京 100050)

牛黃(Bovis calculus)是脊索動物門哺乳綱牛科動物牛(Bos taurus domesticus Gmelin)肝臟的膽結石，始載于《神農本草經》，具有一定的鎮靜作用、明顯的抗驚厥作用和解熱作用，主治咽喉腫痛，口舌生瘡，癰疽疔毒[1]．牛黃是臨床急重病癥常用藥，也是配制中成藥的重要原料，但是天然牛黃稀少難得，遠遠不能滿足含牛黃制劑的藥品需求．為了解決天然牛黃稀缺的狀況，國家食品藥品監督管理局陸續批準3種牛黃代用品：人工牛黃、培植牛黃和體外培育牛黃．

《中國藥典》2015版規定，天然牛黃中按干燥品計算，含膽紅素不得少于25.0%，含膽酸不得少于4.0%[2]70．人工牛黃由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成，含膽紅素不得少于0.63%，含膽酸不得少于13%[2-3]．培植牛黃是利用活牛體，以外科手術的方法在牛的膽囊內插入致黃因子，使之生成牛黃[4-5]．體外培育牛黃以牛科動物牛的新鮮膽汁作母液，加入去氧膽酸、膽酸、復合膽紅素鈣等制成．《中國藥典》2015版規定，體外培育牛黃中按干燥品計算，含膽紅素不得少于35.0%，含膽酸不得少于6.0%[2]．由于牛黃用途廣泛，但來源少、價格昂貴，故有時以人工牛黃或體外培育牛黃作代用品，但由于牛黃與其替代品的性狀特征極為相似，價格又相差較大，市場上用其他牛黃摻偽品時有出現，故牛黃的真偽、質量應受到認真重視．如何鑒別牛黃與其替代品僅見少量報道[6]．

小兒氨酚黃那敏顆粒是由馬來酸氯苯那敏(Chlorphenamine maleate， CM)、對乙酰氨基酚(Paracetamol， PT)及人工牛黃制成的抗感冒復方制劑[6]，市售小兒氨酚黃那敏顆粒大多使用人工牛黃，只有三家藥廠采用體外培育牛黃．對藥品小兒氨酚黃那敏顆粒中體外培育牛黃和人工牛黃的鑒別較少，僅見張軼華等[7]通過檢測膽紅素含量和薄層色譜法鑒別豬去氧膽酸(HA)的方法進行鑒別．體外培育牛黃不含HA，是區別體外培育牛黃和人工牛黃的依據之一，為了更準確鑒別體外培育牛黃和人工牛黃以及含牛黃的藥品小兒氨酚黃那敏顆粒中牛黃種類，本文采用高效液相-蒸發光檢測器(HPLC-ELSD)法檢測HA．該方法簡便，準確，靈敏度高，重現性好．

1 儀器與試藥

Chromaster高效液相色譜儀(chromaster 5310柱溫箱，5210自動進樣器，5110泵，配有Clarity軟件，日本日立公司)；電子天平(XS205 1127423589梅特勒-托利多)；超聲處理器(HU010260B，田間恒奧科技發展有限公司)；Alltech ELSD 6000型蒸發散射光檢測器(美國奧泰公司)．

乙腈、甲醇、甲酸為色譜級；HA標準品購自中國食品藥品檢定研究院；安琪康普力星小兒氨酚黃那敏顆粒(安琪酵母股份有限公司，規格為6 g，每包含PT 0.125 g、CM 0.5 mg、體外培育牛黃5 mg)；三九小兒氨酚黃那敏顆粒劑(三九醫藥股份有限公司，規格為6 g，每包含PT 0.125 g、CM 0.5 mg、人工牛黃5 mg)．

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：島津Intersil ODS-3 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，4.6 μm)；流動相：0.5%甲酸∶乙腈=62∶38；柱溫：40℃．流速：1.0 mL/min，進樣量：20 μL．ELSD漂移管溫度110℃，載氣為高純氮氣，流量：2.8 L/min．

2.2 對照溶液的制備

HA對照品溶液的制備：精密稱取HA對照品約10 mg置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為1 mg/mL HA對照品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀．HA色譜峰保留時間為19.43 min．

1. HA， 1 mg/mL圖1 HA對照品溶液色譜圖

2.3 檢測限

將1 mg/mL HA對照品液逐級稀釋，進樣，信噪比3倍值作為HA的檢測限．本法HA的檢測限為2 μg(質量濃度0.1 mg/mL)．

1. HA，0.1 mg/mL圖2 HA檢測限色譜圖

2.4 體外培育牛黃和人工牛黃的鑒別

分別取體外培育牛黃和人工牛黃，各精密稱取約25 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，超聲10 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得供試品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀．體外培育牛黃和人工牛黃色譜圖見圖3，人工牛黃在19.43 min出現HA色譜峰，而體外培育牛黃卻沒有檢出HA．

A. 人工牛黃，1 mg/mL; B. 體外培育牛黃，1 mg/mL； 1. HA圖3 人工牛黃與體外培育牛黃色譜圖

2.5 小兒氨酚黃那敏樣品的檢測

分別取含體外培育牛黃(安琪康普力星)和人工牛黃(999)的小兒氨酚黃那敏顆粒各10袋，研細，精密稱取約12 g(約相當于牛黃10 mg)，置25 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，超聲20 min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取5 mL續濾液置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得約含牛黃0.2 mg/mL的樣品溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀．樣品色譜圖見圖4，安琪康普力星小兒氨酚黃那敏顆粒中使用體外培育牛黃，并不含HA，而999小兒氨酚黃那敏顆粒中使用人工牛黃，檢出HA．

A.含人工牛黃顆粒(999)； B.含體外培育牛黃顆粒(安琪)； 1.HA圖4 小兒氨酚黃那敏顆粒樣品色譜圖

3 討 論

目前國內含有牛黃成分的中成藥共有500余種，其中多數中成藥中的牛黃成分是價格低廉、藥效較差的人工牛黃，國家食品藥品監督管理局于2004年發布了關于牛黃及其代用品使用問題的通知(國食藥監注[2004]21號)，規定對于國家藥品標準處方中含牛黃的臨床急重病癥用藥品種(42種)和國家藥品監督管理部門批準的含牛黃的新藥，可以將處方中的牛黃以培植牛黃、體外培育牛黃替代牛黃等量投料使用，但不得以人工牛黃替代，其他含牛黃的品種可使用代用品．因此快速鑒別人工牛黃和體外培育牛黃極為重要，呂浩然等[8]通過性狀、顯微及薄層色譜的手段鑒別人工牛黃和體外培育牛黃．性狀鑒別雖簡單易行，但需要鑒別者具有豐富的中藥材知識和實際工作經驗．而薄層色譜法在鑒別HA雖具有快速直觀的優點，但是同時具有靈敏度低的缺點，小兒氨酚黃那敏顆粒及其他藥品中牛黃含量僅為幾個mg，其中HA含量會更低，很難鑒別出來．本法通過HPLC-ELSD法可在含人工牛黃(0.2 mg/mL)的小兒氨酚黃那敏顆粒樣品溶液中準確檢出HA，從而鑒別人工牛黃和體外培育牛黃，具有靈敏度高的特點．