清開靈注射液細菌內毒素檢查法研究

云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

清開靈注射液為八種中藥組成的復方制劑，呈棕黃色或棕紅色澄明液體，具有清熱解毒、化痰通絡、醒神開竅的功能，臨床用于熱病、神昏、中風偏癱、神志不清、急性肝炎、上呼吸道感染等，收載在2015年版《中國藥典》一部。目前標準采用家兔法進行熱原檢查[1]，該檢查方法所用家兔的飼養時間長，操作繁瑣，實驗結果受家兔的個體差異影響較大。而細菌內毒素檢查法具有靈敏、快速、操作簡便、結果準確等優點，為建立該品種細菌內毒素檢查的可行性研究提供數據參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BET-48G細菌內毒素測定儀(天大天發科技有限公司)；ZH-2BLENDER渦式振蕩器(天津藥典標準儀器廠)。

1.2 試劑與藥品 細菌內毒素工作標準品(CSE，批號：1607302，湛江博康海洋生物有限公司)；鱟試劑(TAL，批號1609021、1705041，標示靈敏度0.5 EU/mL，湛江安度斯生物科技有限公司；批號1607270、1708230，湛江博康海洋生物有限公司)；細菌內毒素檢查用水(BET水，批號1607050，湛江博康海洋生物有限公司)；清開靈注射液(批號：170521B2、171031D1、171202A2，神威藥業集團有限公司)。

2 方法和結果

2.1 鱟試劑靈敏度的復核試驗 根據鱟試劑靈敏度的標示值(λ)，用BET水分別將CSE溶解并制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，每一個濃度平行做4管，同時用BET水做2支陰性對照管。按2015年版《中國藥典》(通則1143)[2-3]對TAL進行標示靈敏度復核，由表1可見，不同廠家鱟試劑靈敏度均符合規定。

2.2 內毒素限值(L)的計算 根據公式L=K/M，注射劑K=5 EU/kg·h。M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，根據說明書清開靈注射液最大劑量為40 mL，中國人均體重按60 kg計算，M=40 mL / 60 kg.1 h=0.667 mL/kg·h,則L=7.5 EU/mL。本品的限值設為每1 mL清開靈注射液中含內毒素應小于7.5 EU。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結果

2.3 干擾預實驗最大有效稀釋倍數(MVD)的確定 根據公式MVD=CL/λ，C為供試品溶液的濃度，L為供試品溶液的內毒素限值，MVD= CL/λ=1.0 mL/mL×7.5 EU/mL / 0.50(EU)=15。

2.4 干擾預試驗 將供試品用BET水分別稀釋，制成：原液、5、10、15倍作為供試品系列(NPC)，同時用上述每一個濃度的溶液制備成含1 EU/mL(2λ)濃度的內毒素溶液，將此系列溶液作為供試品陽性對照系列(PPC)。用λ為0.50 EU/mL的2個廠家的TAL分別與2個系列溶液反應，每一稀釋度作2支。BET水作陰性對照(NC)，加入2λ濃度的內毒素標準溶液作為陽性對照(PC)，從表2可見清開靈注射液存在干擾作用，稀釋15倍時，即不再對試驗產生干擾。見表2、表3。

表2 清開靈注射液干擾預試驗結果 (批號1609021，λ=0.5 EU/mL)

表3 清開靈注射液干擾預試驗結果 (批號1607270，λ=0.5 EU/mL)

2.5 干擾試驗 根據干擾預實驗結果，取3批清開靈注射液用BET水分別稀釋15倍，用該稀釋液稀釋CSE，配制成細菌內毒素濃度為1.0、0.5、0.25、0.125 EU/mL的系列溶液及不含供試品的細菌內毒素溶液。每個濃度平行測定4管，分別與TAL反應，同時用供試品溶液和BET水作陰性對照(Tc)，進行干擾試驗，當Tc為陰性時，結果按公式ES=lg-1(∑Xs/4)和Et=lg-1(∑Xt/4)計算，式中Xs和Xt分別為含和不含清開靈注射液系列各反應終點細菌內毒素濃度的對數值。ES均在0.5～2λ范圍內，并且Et在0.5ES-2ES范圍內，說明，15倍稀釋后的清開靈注射液在此試驗條件下，對TAL與細菌內毒素之間的凝聚反應無干擾作用，符合《中國藥典》的判斷標準。同時，可以確定清開靈注射液對TAL不產生干擾的濃度大于15倍，使用現市售標示靈敏度為0.5～0.03 EU/mL的TAL均可對清開靈注射液進行細菌內毒素檢查。見表4、表5。

表4 清開靈注射液干擾試驗結果 (批號1609021，λ=0.5 EU/mL)

表5 清開靈注射液干擾試驗結果 (批號1607270，λ=0.5 EU/mL)

2.6 樣品細菌內毒素檢查法的驗證 取3個批號的供試品分別用BET水稀釋15倍，使用λ=0.25 EU/mL的2個廠家的鱟試劑進行內毒素檢查，并按要求做陽性(PPC、PC)、陰性(NPC、NC)對照，結果3批清開靈注射液的內毒素檢查均符合規定。見表6。

表6 樣品細菌內毒素檢查結果

3 討論

本研究所有表格中“+”表示陽性，“-”表示陰性。其判斷標準是形成凝膠且倒轉180°不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成凝膠不堅固、變形并從管壁滑脫者為陰性。

不同批次供試品對不同廠家的鱟試劑的干擾程度可能存在不同，為了避免因鱟試劑造成的判斷失誤。因此在干擾預試驗中使用了2個廠家的鱟試劑，對3 個批次的清開靈注射液進行凝膠限度法內毒素檢查，結果顯示2個廠家生產的鱟試劑檢驗結果相同，同一廠家不同批次的供試品對鱟試劑的反應結果也無差異， 因此確定清開靈注射液的最大不干擾濃度為稀釋15倍 。

目前《中國藥典》2015年版并未收錄清開靈注射液，也尚無國家標準對其進行細菌內毒素檢查。采用傳統的家兔法檢查熱原，成本高、時間長、影響因素多、靈敏度低。細菌內毒素檢查法相比于家兔熱原檢查法，具有經濟、快捷、靈敏和易于標準化的優點，受到了現代藥品檢驗技術的青睞。因此，開展清開靈注射液內毒素檢查法的研究有著重要的實際意義。

建議 將清開靈注射液質量標準中的熱原檢查項改為細菌內毒素檢查項，規定每1 mL清開靈注射液中含內毒素的量應小于7.5EU。