月之湯方對小鼠免疫功能影響的實驗研究

1.廣禾堂草本生物科技(上海)有限公司，上海 200030；2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006

哺乳期婦女分娩過程中大量消耗體力，產后身體虛弱，免疫力較低，易感染疾病[1]。中國現存最早的婦產科專著《婦人良方大全·產后門》中提到，產婦產后不注重調理，則“小可虛羸，失于將補，便成大患，終身悔而不及”，“經云婦人非止臨產須憂，產后大須將理，慎不得恃身體和平取次為之。乃縱心恣意，無所不為。若有觸傷，便難整理。犯時微若秋毫，感病重如山岳，知命者可不謹之！”[2]。同時，產婦身體機能與乳汁的分泌量、嬰兒生長發育都具有密切關系，需要重視[3]。因此，乳母應提高哺乳期間免疫功能，預防疾病的發生，確保母嬰健康。

現代研究認為，中藥多糖、皂苷類等成分具有調節免疫功能的作用，從根本上提高乳母的抗病能力[4]。月之湯方所含桔梗、山藥、芡實、黃精、薏苡仁等中藥，可增強產后婦女免疫活性，調節產后婦女免疫功能[5]。為觀察月之湯方對小鼠免疫功能的影響，本實驗通過建立小鼠免疫缺陷模型，測定小鼠血液白細胞總數和淋巴細胞數計數、小鼠細胞免疫功能及體液免疫功能、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗，為其增強哺乳期婦女免疫功能提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 藥品及試劑 月之湯方(廣禾堂草本生物科技(上海)有限公司，批號20170326)，生脈膠囊(正大青春寶藥業有限公司，批號20161201)，氫化可的松注射液(安陽九州藥業有限責任公司，批號140820001A)。

1.2 動物 昆明種SPF級小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體重18～22g，購自南方醫科大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK( 粵) 2011-0015。

1.3 儀器 XE-2100型全自動血細胞分析儀(希森美康醫用電子(上海)有限公司)，PS-2013秒表(深圳市追日電子科技有限公司)，ME204E102型萬分之一天平電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

2 方法和結果

2.1 樣品液配制 受試樣品配制：月之湯方加熱水溶解，配制成0.5、1、1.5 g·mL-1的混懸液。對照組藥物樣品配制：取生脈膠囊9粒(0.06 g·mL-1) ，用研缽研碎呈粉末后加水至50 mL，臨用前現配。

2.2 對小鼠血液白細胞總數和淋巴細胞數的影響[6]取昆明種小鼠60只，隨機分為正常對照組、模型組、月之湯方低劑量組( 5.2 g·kg-1)、中劑量組(10.4 g·kg-1)、高劑量組( 15.6 g·kg-1)、陽性藥物組(0.6 g·kg-1)，每組10只，按10 mL·kg-1灌胃給藥，空白及模型組給予等體積蒸餾水。每日灌胃1次，連續灌胃給予受試物30天，實驗期間自由進食。于第3周后，建立小鼠免疫缺陷模型，各組動物肌肉注射免疫抑制劑氫化可的松40 mg·kg-1，共5次，間隔24 h，在末次注射給藥后次日測定各項指標，進行組間t檢驗分析。

實驗第31天利用摘除小鼠眼球的方法采集全血。采用無菌潔凈的眼科鑷子摘取小鼠一側或雙側眼球，使血液自由滴入裝有抗凝劑的1.5 mL離心管中。采血過程中將血液與抗凝劑不斷搖勻，防止血液凝固，每只動物采集抗凝全血約1 mL。上機前將血液顛倒混勻，過程中注意檢查其是否存在凝塊，并于24 h內應用全自動血細胞分析儀對小鼠血液樣品中白細胞總數和淋巴細胞數進行檢測。

2.3 對小鼠細胞免疫功能的影響[7]分組、給藥及造模同2.2，實驗第25天，使用脫毛劑除去小鼠右側背中部的毛發。實驗第26天，使用微量加樣器于小鼠脫毛部位滴涂5% 2,4-二硝基氟苯溶液(DNFB)20μL致敏。實驗第30天，小鼠左耳殼(兩面)滴涂1%DNFB溶液20μL作為攻擊；小鼠右耳滴涂丙酮、麻油混合液20 μL作為對照。實驗第31天(即攻擊后24 h)，稱取各小鼠體重并頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片，立即稱重。以(左耳片重量-右耳片重量)為耳廓腫脹度表示遲發型超敏反應(DTH)的強度。同時，取小鼠胸腺、脾臟稱重，以小鼠脾臟、胸腺濕重(mg)各作為脾臟指數和胸腺指數。計算公式見公式1。

公式1

2.4 對小鼠體液免疫功能的影響[8]分組、給藥及造模同2.2。實驗第26天，每只鼠腹腔注射壓積為2%(V/V)綿羊紅細胞(SRBC)0.2 mL進行免疫。間隔4天后，摘除小鼠眼球并取血于離心管內，放置約1 h，將凝固血與管壁剝離，使血清充分析出，2000 r·min-1離心10 min，收集血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內，每孔100 μL，再加入0.5%(V/V)的SRBC懸液100 μL，混勻，裝入濕潤的平盤內加蓋，于37℃溫箱孵育3 h，觀察各組小鼠血球凝集程度。

其中，血清凝集程度一般分為5級(0-Ⅳ)記錄，按公式2計算抗體積數。若受試樣品組的抗體積數顯著高于對照組的抗體積數，則可判定該項實驗結果為陽性。

抗體積數=(S1+2S2+3S3……nSn)

公式2

式中1、2、3……n代表對倍稀釋的指數，S代表凝集程度的級別，抗體積數越大，表示血清抗體越高。

0級紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清晰。

Ⅰ級紅細胞大部分沉集在孔底成園點狀，四周有少量凝集的紅細胞。

Ⅱ級凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點。

Ⅲ級凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層,中心隱約可見一個小紅點。

Ⅳ級凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。

2.5 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響[9]分組、給藥及造模同2.2。實驗第28天，小鼠腹腔注射6%淀粉液1 mL，連續注射3日。3日后，小鼠腹腔注射1%的雞紅細胞懸液2 mL，輕揉腹部使雞細胞分散。25～30 min椎脫臼法處死小鼠并對小鼠腹腔注射生理鹽水2 mL。在干凈的載玻片上滴加一滴生理鹽水，同時向其中滴加一滴小鼠腹腔液。靜置10 min，腹腔巨噬細胞貼壁后，棄去生理鹽水，并對稍干后的標本滴加3～4滴瑞氏染液進行染色，以完全蓋住標本為宜。5 min后甩去標本玻片上多余染液，自來水輕洗，吸水紙吸干，干燥后油鏡鏡檢。按公式3和公式4分別計算吞噬百分率及吞噬指數，進行組間比較。

公式3

公式4

3 結果

3.1 對小鼠血液白細胞總數和淋巴細胞數的影響 月之湯方5.2、10.4、15.6 g·kg-1劑量組的白細胞總數和淋巴細胞數顯著高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。結果見表1。

表1 月之湯方對小鼠白細胞總數及淋巴細胞數的影響 ±s,n=12)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

3.2 對小鼠細胞免疫功能的影響 月之湯方5.2 g·kg-1劑量組耳廓腫脹度、脾臟指數顯著低于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果見表2。

表2 月之湯方對小鼠細胞免疫功能的影響 ±s,n=12)

注：與模型組比較，*P<0.05。

3.3 對小鼠體液免疫功能的影響 月之湯方5.2、10.4 g·kg-1劑量組的抗體積數分別為27.77±9.55、30.55±7.88，均顯著高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。結果見表3。

3.4 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響 月之湯方5.2、10.4、15.6 g·kg-1劑量組的吞噬百分率顯著高于模型組，月之湯方5.2 g·kg-1劑量組的吞噬指數顯著高于模型組，差異均具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。結果見表4、圖1。

表3 月之湯方對小鼠體液免疫功能的影響 ±s,n=12)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

表4 月之湯方對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響 ±s,n=12)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

4 討論

傳統中醫學理論認為產后婦女具有氣血虧損，臟腑虛弱，瘀血阻滯，心氣不足，易感風寒的生理特點[10]。產婦作為特殊人群，在增強其免疫功能方面應給予充分重視。

月之湯方源自生化湯裁剪變化而成[10]，生化湯被譽為“血塊圣藥”，是治療產后諸癥的重要代表方劑。傳統中醫學理論認為產后用藥原則應以補氣養血、調和脾胃為主，月之湯方含有桔梗、山藥、芡實等多種中藥，其所含有的天然多糖、皂苷類等成分已被證明具有抗腫瘤和免疫增強的作用，而其他成分往往起協同或輔助增強免疫作用[11]。

白細胞總數及淋巴細胞數可衡量機體接受免疫抑制劑后的免疫應答功能，脾臟和胸腺的相對重量、吞噬百分率及吞噬指數均是衡量機體非特異性免疫功能的重要指標。本次實驗結果提示月之湯方為免疫增強劑，能夠明顯增加小鼠血液白細胞總數和淋巴細胞數，提高小鼠細胞免疫與體液免疫功能，可不同程度提高抗體活性。

綜上所述，月之湯方能夠調節人體免疫機能，增加人體免疫力，為其開發成增強免疫類保健食品提供理論依據。