甘蔗花葉病毒衣殼蛋白的原核表達及抗血清制備

許小潔?┱偶濤? 徐德坤 殷復偉 田延平 李向東

摘要：將甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）第Ⅰ組分離物DWK1和第Ⅳ組分離物DWK2的衣殼蛋白（coat protein，CP）基因分別克隆到原核表達載體pEHISTEV，得到重組質粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP。將兩個重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta，經IPTG誘導，均表達出分子量為38 kD的融合蛋白。切膠回收融合蛋白，免疫新西蘭長耳兔5次，獲得了SCMV-Ⅰ CP和SCMV-Ⅳ CP的多克隆抗體。間接ELISA結果表明，兩種血清的效價均達到1∶8192。Western Blot結果表明，利用SCMV-ⅠCP制備的抗血清與DWK1反應更強，而利用SCMV-Ⅳ CP制備的抗血清與DWK2反應更強。本研究為SCMV檢測及CP功能研究奠定了基礎。

關鍵詞：甘蔗花葉病毒；衣殼蛋白；原核表達；抗血清；檢測

中圖分類號：S435.131.4+9：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）08-0106-04

Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of

Sugarcane Mosaic Virus Coat Protein

Xu Xiaojie1，2， Zhang Jiwu1*， Xu Dekun3， Yin Fuwei4， Tian Yanping1， Li Xiangdong1，2

（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University/Laboratory of Plant Virology， Taian 271018， China；

2. Shandong Provincial Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Taian 271018， China；

3. Linyi Plant Protection Station， Linyi 276001， China； 4. Taian Agricultural Technology Station， Taian 271000， China）

Abstract The coat protein （CP） genes of Sugarcane mosaic virus （SCMV） groups Ⅰ （isolate DWK1） and IV （isolate DWK2） were amplified by RT-PCR and cloned into prokaryotic expression vector pEHISTEV， and produced recombinant plasmids pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP and pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP. The recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli strain Rosetta and could both express a fusion protein with molecular weight of 38 kD after induction with IPTG. The fusion protein was cut from the gel， emulsified and used to immunize the New Zealand long-eared white rabbits five times to produce polyclonal antiserum against SCMV-Ⅰ CP and SCMV-Ⅳ CP. Indirect ELISA results showed that the titers of the two antisera reached 1∶8192. Western Blot results indicated that the antiserum prepared with SCMV-Ⅰ CP showed stronger positive reaction than DWK1， while that prepared with SCMV-Ⅳ CP was more responsive to DWK2. The antiserum prepared here provided solid foundation for the detection of SCMV and the functional studies of SCMV CP.

Keywords Sugarcane mosaic virus； Coat protein； Prokaryotic expression； Antiserum； Detection

矮花葉病是玉米上的一種重要病毒病害。玉米矮花葉病1968年在我國河南省新鄉、安陽一帶發生[1]，現在我國玉米主產區均有分布，是限制玉米持續高產穩產的重要因素。引起我國玉米矮花葉病的主要毒原為甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）[2]。

SCMV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae）馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），可以由蚜蟲傳播，也可通過種子傳播。SCMV病毒粒體為線狀，長700～750 nm。其基因組為正單鏈RNA。根據全基因組序列的系統發育分析，SCMV分為4個組，其中第Ⅰ組分布最為廣泛，第Ⅳ組是新發現的一個強毒株系，可侵染全部20個供試玉米品種[3]。第Ⅳ組分離物發生呈逐年上升趨勢，最早在河北省發現，目前山東、湖北等地已出現，國外東非等地也有報道[4，5]。

早期檢測對SCMV等植物病毒的防治非常關鍵。血清學方法具有操作簡單、特異性強、靈敏度高等優點，是植物病毒檢測中最常用的方法。利用提純病毒制備抗血清所需周期長，有些病毒難以提純或者在植物體內濃度很低，無法獲得高質量的抗體。本研究利用大腸桿菌表達的SCMV CP制備了效價高、特異性強的抗血清。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

兩個感染SCMV的玉米樣品均采自山東泰安岱岳區大汶口鎮（北緯35°57′14.05″，東經117°04′58.66″）， 經檢測樣品1中的毒原DWK1屬于SCMV第Ⅰ組，樣品2中的毒原DWK2屬于SCMV第Ⅳ組[6]。

原核表達載體pEHISTEV和大腸桿菌（Escherichia coli）菌株Rosetta（DE3）均由英國安德魯斯大學劉煥庭惠贈。大腸桿菌菌株DH5α由本實驗室保存。

限制性核酸內切酶、T4 DNA聚合酶、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、不含RNA酶的雙蒸水、Taq DNA聚合酶、dNTP購自TaKaRa公司；Phusion DNA聚合酶、Western Blot所用蛋白分子量標準購自Thermo公司；植物總RNA提取試劑盒TransZol、PCR產物凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒為TransGen公司產品；硝酸纖維素膜（NC）為Pall Gelman公司產品；堿性磷酸酯酶標記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔IgG、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑購自Sigma公司；IPTG、DTT、甲醇等其它試劑為進口或國產分析純。

1.2 引物設計

根據SCMV DWK1和DWK2（登錄號分別為KU171814和KU171815）全基因組序列，設計克隆SCMV Ⅰ和Ⅳ組分離物CP基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。克隆SCMV-Ⅰ CP的正向引物為SCMVcp-Ⅰ-Nco Ⅰ-F（5′-CATGCCATGGCTTCCGGAACTGTGGATGCAG-3′；下劃線部分為NcoⅠ酶切位點），反向引物為SCMVcp-Ⅰ-EcoRⅠ-R（5′-CCGGAATTCTTAGTGGTGCTGCTGCACTCCC-3′；下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點），擴增片段預期大小為939 bp。克隆SCMV-Ⅳ組分離物CP的正向引物為SCMVcp-Ⅳ-NcoⅠ-F（5′-CATGCCATGGCTTCTGGTCAAGTTGACGCAGGG-3′；下劃線部分為NcoⅠ酶切位點），反向引物為SCMVcp-Ⅳ-EcoRⅠ-R（5′-CCGGAATTCTTAGTGATGTTGCTGCACTCCCAAC-3′；下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點），擴增片段預期大小為939 bp。

1.3 原核表達載體構建及表達

利用TransZol試劑盒提取感染DWK1和DWK2玉米樣品總RNA，選擇隨機引物進行反轉錄合成cDNA， 利用引物對SCMVcp-Ⅰ-Nco Ⅰ-F和SCMVcp-Ⅰ-EcoR Ⅰ-R、SCMVcp-Ⅳ-Nco Ⅰ-F和SCMVcp-Ⅳ-EcoRⅠ-R分別擴增SCMVⅠ組和Ⅳ組分離物（DWK1和DWK2）的CP基因。PCR程序為：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，65℃退火20 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，紫外燈下切取目的條帶，經PCR產物凝膠回收試劑盒回收純化后，用NcoⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切，與相同酶切處理的pEHISTEV載體通過T4連接酶連接，轉化大腸桿菌E. coli DH5α感受態細胞。采用PCR、酶切驗證篩選陽性克隆，由濟南博尚公司測序驗證。

將測序驗證后的陽性克隆轉化E. coli菌株Rosetta感受態細胞。挑取單菌落用3 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養基于37℃培養12 h，取1 mL菌液加入150 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養基中，37℃、200 r/min振蕩培養2.5～3.0 h，調整OD600值為0.4～0.6，加 IPTG至終濃度為100 mmol/L，28℃搖菌5～6 h。經4℃、12 000 r/min離心2 min后收集菌體，加適量pH 8.0 TE緩沖液振蕩懸浮，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min，-20℃放置5 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，取10 μL上清進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況。

1.4 抗血清制備、效價及特異性測定

原核表達的蛋白經電泳后，用4℃預冷的含 0.25 mol/L KCl 和1 mmol/L DTT的顯色液進行染色，切取目的蛋白條帶于預冷的研缽中，按1∶1（W/V）加入0.9%生理鹽水充分研磨。初次免疫加等體積的弗氏完全佐劑進行乳化，采取皮下多點注射新西蘭長耳兔，一周后改用弗氏不完全佐劑進行蛋白乳化，以后每隔一周注射一次，共5次。最后一次免疫一周后取血，分離血清后，于-20℃長期保存。

將感染DWK1和DWK2的玉米葉片按1∶10（W/V）的比例加入抗原包被緩沖液（0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.6）充分研磨后，加入酶聯板中，再以相同的方法處理健康玉米葉片作為陰性對照。按照1∶26～1∶214對抗血清進行梯度稀釋。顯色后使用酶標儀讀取OD405的值，以I（待測樣品讀數-空白讀數）/H（陰性樣品讀數-空白讀數）≥2作為陽性反應。以能出現陽性反應的抗體最大稀釋倍數作為抗血清的效價[7]。

根據Towbin等[8]的方法進行Western Blot，分析抗血清的特異性。（1）抗血清對DWK1、DWK2特異性測定：兩種抗血清均以感染DWK1和DWK2的玉米葉片為檢測對象，以健康玉米葉片為陰性對照。（2）抗血清對表達產物的特異性檢測：以pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP、pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP原核表達產物為檢測對象，以pEHISTEV空載體原核表達產物為陰性對照。樣品蛋白經SDS-PAGE電泳后于4℃轉至NC膜，再用5%脫脂奶粉溶液將NC膜4℃封閉過夜。洗滌后，加入1∶500稀釋的抗血清孵育3 h，洗滌后加入HRP-鼠抗兔IgG稀釋液（1∶50 000稀釋）。將HRP-ECL化學發光所用A、B發光液按1∶1混合，覆于NC膜上，用ChampChemi全自動化學發光儀觀察結果。

2 結果與分析

2.1 SCMV-Ⅰ和SCMV-Ⅳ CP基因克隆及原核表達

通過RT-PCR方法從感染DWK1、DWK2玉米葉片中均克隆到940 bp左右的DNA條帶（圖1），與預期大小相符。經NcoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，連接到相同酶切處理的pEHISTEV載體，獲得重組質粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP。轉化E. coli Rosetta，經IPTG誘導表達后，通過SDS-PAGE電泳結果檢測目的蛋白表達情況。含有重組質粒pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP的Rosetta細胞表達出了分子量在38 kD左右的蛋白，與預期大小一致，而攜帶pEHISTEV空載體的Rosetta細胞中沒有該蛋白（圖2），表明SCMV CP基因在大腸桿菌中得到了正確表達。

2.2 抗血清制備及效價測定

原核表達的CP蛋白經SDS-PAGE分離，用KCl染色后切膠回收，乳化后經皮下多點注射免疫新西蘭長耳兔，注射5次后獲得SCMV-Ⅰ和SCMV-Ⅳ CP的抗血清。分別用相應的抗原測定抗血清的效價，陰性對照均為健康玉米葉片。間接ELISA結果表明，在病汁液稀釋10倍時，利用原核表達的DWK1和DWK2 CP制備的抗體效價均可達到1∶8192（如表1）。

2.3 抗血清特異性檢測

Western Blot分析顯示，利用本研究制備的抗血清分別檢測pEHISTEV-SCMV-Ⅰ-CP和pEHISTEV-SCMV-Ⅳ-CP的原核表達產物時，均在分子量38 kD處出現一條特異性條帶（圖3），與SDS-PAGE中CP蛋白的大小一致；兩種血清與DWK1、DWK2均存在特異性反應，但與相對應的抗原反應更強烈（利用原核表達的SCMV-Ⅰ CP制備的抗血清和DWK1反應更強，而用原核表達的SCMV-ⅣCP制備的抗血清和DWK2反應更強），兩種血清與健康寄主汁液無反應（圖4），說明制備的抗血清有較好的特異性。

3 討論與結論

陳啟建等[9]利用提純SCMV病毒免疫家兔制備抗血清，其效價為1∶1024。李向東等[10]利用原核表達的SCMV CP制備的抗體效價可以達到1∶2048。本研究利用原核表達的CP制備了SCMV第Ⅰ組和第Ⅳ組分離物CP的抗體，效價可達1∶8192。

因為SDS的作用，SDS-PAGE分離蛋白時造成了蛋白的變性。利用切膠回收的蛋白制備的抗體有時候只能用于Western Blot分析，而不能用于ELISA檢測。本研究制備的抗體可以用于ELISA 檢測，而且效價達到1∶8192。

SCMV第Ⅳ組分離物是近年新出現的，和其它組分離物的CP氨基酸序列差異較大[3，5]。利用SCMV第Ⅰ組分離物DWK1和第Ⅳ組分離物DWK2 CP制備的抗體有交叉反應，但又有明顯不同。兩種血清具有互補性，如果聯合使用，可以提高SCMV的檢出成功率，減少漏檢。

本研究制備的抗血清為監測SCMV發生情況奠定了堅實基礎。

參 考 文 獻：

[1] 何廣達，王祖云. 玉米矮花葉病問題的探討[J]. 河北農學報， 1984， 9 （4）： 56-60.

[2] Jiang J X， Zhou X P. Maize dwarf mosaic disease in different regions of China is caused by Sugarcane mosaic virus[J]. Archives of Virology， 2002， 147： 2437-2443.

[3] Gao B， Cui X W， Li X D， et al. Complete genomic sequence analysis of a highly virulent isolate revealed a novel strain of Sugarcane mosaic virus[J]. Virus Genes， 2011， 43： 390-397.

[4] Yan Z Y， Cheng D J， Li X D， et al. First report of Sugarcane mosaic virus group IV isolates from the corn production fields in China [J]. Plant Disease， 2016， 100：1508.

[5] Mahuku G， Lockhart B E， Wanjala B， et al. Maize lethal necrosis （MLN）， an emerging threat to maize-based food security in Sub-Saharan Africa [J]. Phytopathology， 2015， 105： 956-965.

[6] 程德杰， 閆志勇，黃顯德，等. 甘蔗花葉病毒兩個山東分離物的全基因組序列分析[J]. 植物病理學報，2017，47（3）： 357-363.

[7] 黃顯德，王玉，田延平，等. 番木瓜環斑病毒西瓜株系衣殼蛋白的原核表達及抗血清制備[J]. 山東農業科學，2017，49（12）： 86-89.

[8] Towbin H，Staehlin T，Gordon J.Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets： procedure and some application[J].Proc. Natl. Acad. Sci.USA，1979，76（9）：4350-4354.

[9] 陳啟建，周仲駒. 甘蔗花葉病毒的提純及抗血清制備[J].亞熱帶農業研究， 1998（1）：19-21.

[10]李向東， 范在豐， 石鵬君，等. 甘蔗花葉病毒CP基因的高效表達和抗血清制備[J]. 生物技術通訊，2003， 14（4）： 271-273.