我國中低緯度地區白蠟DNA圖譜構建及SSR標記遺傳多樣性分析

李慶國 劉翠蘭 姚俊修 王因花 王開芳 任飛 燕麗萍 吳德軍

摘要：白蠟是我國一種常見綠化樹種，因緯度位置、海拔高度和海陸分布等自然地理因素不同，造成地區之間種質資源的自然差異。真實性和純度是種質資源檢測的重要指標之一，因此建立快速、精準、便捷的 SSR分子標記技術對于白蠟種質的溯源及新品種授權具有重要意義。本研究以2013年山東省林業科學研究院在白蠟種質資源調查項目中采集并保存的38份白蠟為試材，利用SSR分子標記技術對我國不同緯度地區的白蠟種質資源進行指紋圖譜構建，從150對候選引物中成功篩選出15條特異性強、條帶清晰的引物作為核心引物，共檢測出3.8個基因型，每對引物擴增的基因型2～6個不等。并構建白蠟DNA指紋圖譜，采用5對引物組合即可將38份白蠟種質完全區分。聚類分析結果表明，白蠟種質間的親緣關系與緯度因素具有一定的相關性。

關鍵詞：白蠟；中低緯度地區；SSR；DNA 指紋圖譜；遺傳多樣性

中圖分類號：S792.41：Q75 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）08-0019-05

Construction of DNA Fingerprinting and Analysis of

Genetic Diversity with SSR Markers for Fraxinus sp.

in Mid-Latitudes and Low-Latitudes of China

Li Qingguo1， Liu Cuilan1，2，Yao Junxiu1，2， Wang Yinhua1，2，

Wang Kaifang1，2，Ren Fei1，Yan Liping1，2，Wu Dejun1，2

（1. Shandong Academy of Forestry Sciences， Jinan 250014， China；

2. Shandong Provincial Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement， Jinan 250014， China）

Abstract Fraxinus is a kind of common greening tree species in China. Because of the latitude， altitude，sea land distribution and other different natural geographic factors， the natural differences are present between regions and germplasm resources. The authenticity and purity are one of the important indexes for germplasm resource detection. Therefore， it is of great significance to establish a rapid， accurate and convenient DNA molecular marker technique for the traceability of Fraxinus germplasms and the authorization of new varieties. In this study， 38 samples of Fraxinus collected and preserved by Shandong Academy of Forestry Sciences in 2013 were tested. The construction of DNA fingerprinting and analysis of genetic diversity with SSR markers were conducted for Fraxinus in mid-latitudes and low-latitudes. And 15 primers with high specificity and clear bands were selected as core primers from 150 pairs of candidate primers. A total of 3.8 genotypes were detected， and each pair of primers amplified 2～6 genotypes. The Fraxinus could be distinguished by 5 primers. This indicated that there were correlations between phylogenetic relationships and geographic origin of different varieties.

Keywords Fraxinus； Mid-latitudes and low-latitudes； SSR； DNA fingerprinting； Genetic diversity

白蠟由于其耐鹽性極強、觀賞價值高和分布范圍廣等特點，被國內許多省市廣泛引種栽培，是目前應用最廣泛的綠化樹種之一[1]。國內對白蠟育種的研究起步比較早，但多限于對絨毛白蠟的變異觀測和人工林栽培選擇育種方面，且未廣泛采用生物技術等新興技術開展研究，致使白蠟遺傳育種方面的研究遲滯不前，培育出的優良品種很少[2，3]，在一定程度上造成白蠟種質資源的浪費；同時，現有白蠟種間鑒別不清的問題也普遍存在[4]，白蠟種內的變異類型沒有一致的劃分標準，分類不明晰，缺少白蠟種質基因庫以及種質資源保護、評價、推廣和利用的綜合體系建設[5]。由于形態鑒定的時效性差，極易受到環境與主觀因素的影響，使得依據形態性狀進行品種田間檢驗的難度越來越大[6]，品種多、雜、亂的現象難以得到有效控制。

隨著分子生物學的迅速發展，采用分子標記鑒別植物品種得到廣泛應用。SSR分子標記具有快速簡單、自動化等優點，基于此的DNA 指紋圖譜鑒定技術精準、可靠，不受季節和環境的影響，是品種鑒定的最主要分子標記技術之一[7]。國際植物新品種權保護聯盟（UPOV）在分子標記測試指南中即采用SSR和SNP標記方法構建DNA指紋數據庫，其中SSR標記價廉、技術成熟，是目前植物基因組建庫的首選標記[8]。近年來，科研人員已基于SSR標記構建了玉米[9]、甜瓜[10]、中國櫻桃[11]、杏[12]、杜仲[13]等的基因組DNA指紋圖譜數據庫。在白蠟樹種分子標記研究方面，王健兵等[14]利用正交設計試驗優化了白蠟SSR反應體系，篩選出多態性、穩定性、重復率均較高的SSR引物標記，為白蠟種質SSR分子標記的鑒定奠定了基礎；胡春龍[15]采用SSR標記方法，對白蠟種質資源分子身份證及遺傳多樣性進行了研究。但關于中國不同緯度地區的白蠟種質開展DNA指紋圖譜構建及應用的研究還未見報道。本研究采用SSR標記對2013年收集的中國不同緯度地區部分白蠟種質進行DNA指紋圖譜構建，并進行遺傳多樣性分析，對白蠟品種鑒別、種質資源管理、雜交育種、知識產權保護和苗木質量提高均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗所用的38份白蠟試材為2013年山東省林業科學研究院白蠟種質資源調查項目組采自黑龍江、新疆、北京、甘肅、山東、陜西和湖南6個省市，均為當地樹齡長且具有干形直、綠期長等優良特性的白蠟種質（表1）。

1.2 DNA的提取及檢測

按照均勻分布、隨機采集的原則取白蠟試材的新鮮葉片并置于-50℃保存，采用改進 CTAB法提取基因組DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，帶型清晰（圖1），符合實驗要求。

1—13分別指白蠟1號—白蠟13號。

圖1 白蠟基因組DNA檢測

1.3 引物篩選和PCR擴增

選取田間表型性狀差異較大的4份白蠟種質提取DNA進行SSR引物篩選，所用引物由山東省林業科學研究院通過轉錄組測序開發，初步選出150對SSR引物作為本研究的候選引物，由山東沃恩科技有限公司合成。PCR反應體系：10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，5～10 ng/μL DNA模板0.2 μL，10 ng/μL PCR-Mix 5.5 μL，ddH2O 3.7 μL，共計10 μL。PCR反應條件：94℃ 預變性3 min；94℃變性1 min，54～58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min，4℃ 10 min終止反應。擴增產物進行8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測：擴增產物點樣3.5 μL，分子量標準為50 bp DNA Ladder，在200 V 電壓下預電泳30 min，之后電泳2 h，在0.1%的AgNO3 溶液中銀染，漂洗，NaOH 溶液中顯色[16]，凝膠掃描保存，統計數據后進行分析。

1.4 數據處理

根據SSR擴增目標產物在電泳凝膠上的大小和重復單元，每對引物產生的不同帶型，建立其DNA分子指紋圖譜。利用NTSYS-pc V 2.10軟件，將數據格式轉換為軟件計算格式，采用Popgene 32軟件計算I值（Shannons information index）和H值（Neis gene diverity），多態信息含量PIC值 （polymorphism information content）參考Nei的方法進行計算[17]。采用最短距離法得出PUGMA親緣關系圖。

2 結果與分析

2.1 SSR標記多態性分析

用150對引物（Y1～Y150）對4份白蠟種質進行擴增，初步篩選出15對特異性強、穩定性好的多態性引物，15對引物對38份白蠟材料的擴增結果見表2，共擴增出57個多態性位點，每對引物的多態性位點2～6個不等，平均每對引物擴增出3.8個多態性位點。不同位點的PIC值變化范圍為0.625 1～0.917 1，平均PIC值為0.807 7；I值最大為0.921 4，平均值為0.757 3；H值平均為0.777 9。一般認為PIC>0.50時為高度多態性信息引物，當0.25

2.2 品種指紋圖譜分析

利用篩選的15對引物對38份白蠟種質進行指紋分析，僅用1個特征引物Y132就可將白蠟7號、白蠟10號、白蠟13號、白蠟14號、白蠟15號、白蠟18號、白蠟23號、白蠟26號、白蠟32號、白蠟34號共計10份種質與其它種質區分開。白蠟1號、白蠟3號和白蠟4號具有5個特征引物，白蠟2號、白蠟5號、白蠟9號、白蠟11號、白蠟20號和白蠟21號具有2個特征引物，白蠟25號具有3個特征引物。引物Y78、Y132在36份白蠟種質上均表現出特征譜帶，說明這兩個引物多態性豐富，特征譜帶穩定，在進行白蠟種質指紋鑒定時可優先采用。

從15 對引物中挑選多態性相對豐富的Y78、Y132和Y149引物進行組合鑒別，可以鑒別26份種質。Y55、Y78、Y132和Y149引物組合可鑒別34份種質，白蠟1號、白蠟5號、白蠟6號、白蠟12號4個種質無法區分，而引物Y39在這4份白蠟種質中顯現出4種不同基因型，因此，采用Y39、Y55、Y78、Y132和Y149組合可將來自不同緯度地區的38份白蠟種質完全區分開。

2.3 不同來源地無性系之間的親緣關系

利用SSR標記對38份白蠟種質進行聚類分析，結果見圖2。可以看出，在0.63的聚類水平上，可以將38份種質分為兩個大類。第一大類只有一份種質白蠟18號，是課題組從湖南省引進的種質資源。第二大類包括37份種質，在0.43的聚類水平上，可劃分為兩個亞類，第一亞類包括白蠟2號、白蠟4號、白蠟8號、白蠟10號、白蠟12號、白蠟14號、白蠟22號、白蠟24號、白蠟26號、白蠟30號、白蠟32號、白蠟36號共12個種質，其中5個種質來自黑龍江，4個種質來自北京，3個種質來自新疆；第二亞類包括白蠟1號、白蠟3號、白蠟5號、白蠟6號、白蠟7號、白蠟9號、白蠟11號、白蠟13號、白蠟15號、白蠟16號、白蠟17號、白蠟19號、白蠟20號、白蠟21號、白蠟23號、白蠟25號、白蠟27號、白蠟28號、白蠟29號、白蠟31號、白蠟33號、白蠟34號、白蠟35號、白蠟37號、白蠟38號共25個種質，其中11個種質來自陜西，9個來自山東，4個來自甘肅，1個來自北京。SSR分子標記的聚類結果與種質的緯度空間分布具有一定的相關性。可見，SSR分子標記在一定程度上反映了種質的地理分布特點。

3 討論與結論

解決白蠟育種和種質資源管理方面的問題，研究其物種的遺傳多樣性和種質間的親緣關系具有非常重要的意義[19]。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測SSR技術對白蠟種質SSR反應體系進行優化和遺傳多樣性分析，前人已有研究報道，其結果為平均每對引物檢測到3.5個多態位點，多態性信息含量（PIC）平均為0.548 0[14，15]。本研究遴選了15對多態性引物對38份白蠟屬植物進行遺傳多樣性分析，所有引物均表現出了多態性，每對引物的多態性位點2～6個不等，平均每對引物擴增出3.8個多態性位點；不同位點的PIC值變化范圍為0.625 1～0.917 1，平均PIC值為0.807 7，這一結果高于前人的研究結果，可能與所選用的38份白蠟種質來自中國的中、低緯度不同地區有關。黎中寶等[20]曾對不同緯度地區的桐花樹進行遺傳多樣性研究，得出的結論為桐花樹的親緣關系與地理因素具有一定的相關性。

目前很多國家在林木新品種審定時都需要DUS證明，用于區分新品種與已知品種的不同[21，22]。近年來SSR分子標記技術由于具有簡單、重復性好、共顯性的特點得到廣泛運用。本試驗采用SSR技術構建了中國不同緯度地區38份白蠟種質的DNA指紋圖譜，從15對SSR引物中篩選出5對Y39、Y55、Y78、Y132和Y149組合可將來自不同緯度地區的38份白蠟種質完全區分開。隨著白蠟新品種的不斷推出，品種的指紋圖譜還需要不斷加強，這就需要研究者不斷篩選出新的核心引物，為今后新的品種盡可能提供指紋認證，只有如此，才可能更好地構建種質資源保護、評價、推廣、利用的綜合體系建設[18，23]。

本研究聚類分析結果顯示，以緯度為分類可將所有種質分為2大類，來自低緯度湖南的聚為一類，而來自新疆、黑龍江、甘肅、陜西、北京、山東中緯度地區的白蠟種質聚為一類，說明緯度因素對種質有很大影響，即種質間的親緣關系與地理來源有一定的相關性。來源緯度相近的黑龍江5個、北京4個、新疆3個種質聚為一類；來源緯度相近的陜西11個、山東9個、甘肅4個、北京1個種質聚為一類。可以看出大部分地理來源相同的種質聚在了同一類群中，但也有少部分不同地理來源的種質聚在同一類群，這可能是由于不同生態環境下種質資源的基因交流，導致不同生境條件下的種質資源的親緣關系發生了變化[24-26]。不同種植區的生態環境變化和地區間產生的基因交流也有利于其遺傳變異的積累和保持。

參 考 文 獻：

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