miR-222在藏豬和DLY豬背最長肌和腰大肌中的表達差異研究

鄭 婷，甘麥鄰，李 強，鐘志君，張順華*，朱 礪*

（1．四川農業大學動物科技學院，四川 成都 611130；2．四川省畜牧總站，四川 成都 610041；3. 四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066）

動物肌肉組織是人類主要的蛋白質來源之一，對于農場動物，尤其是肉用家畜來說，產肉是最重要的經濟性狀之一，動物骨骼肌的發育情況直接決定了其產肉能力和肉品質。脊椎動物的骨骼肌細胞是一種經過復雜的分化過程形成的具有收縮功能的多核細胞。在動物胚胎發育的過程中，來自中胚層的祖細胞首先進行增殖，隨后退出細胞周期在生肌調節因子（myogenic regulatory factors， MRFs）的驅動下分化、融合成肌管，最終形成肌纖維[1-2]。通常根據肌纖維表達的肌球蛋白重鏈（Muscle heavy chains， MyHC）亞型的差異可將骨骼肌分為慢速氧化型肌纖維（MyHCⅠ）、快速氧化型肌纖維（MyHCⅡa）、快速酵解型肌纖維（MyHCⅡb）和中間型肌纖維（MyHCⅡx），肌纖維類型決定了肌肉的運動能力和代謝類型，同時還與畜產品肉品質密切相關[3]。在豬中背最長肌是典型的快速酵解型肌肉（又稱白肌），而腰大肌為典型的慢速氧化型肌肉（又稱紅肌）[4]。microRNA是近年來發現的一種長度約22nt的非編碼RNA，主要在其靶基因的轉錄后水平發揮調控作用，近年來越來越多的microRNA被報道參與了骨骼肌的發育調控，如miR-1、miR-133、miR-206等[5]。miR-222在此前的研究報道中已被發現可以抑制骨骼肌細胞成肌細胞的分化[6-7]。但miR-222在豬骨骼肌中的表達及其是否調控豬不同骨骼肌肌纖維類型的發育還未見報道。因此本試驗以藏豬（地方品種豬）和DLY豬（外種豬）的背最長肌（白肌）和腰大肌（紅肌）為試驗材料，分析miR-222在背最長肌和腰大肌的表達特性，以期為進一步研究miR-222對豬骨骼肌發育和肌肉品質的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雌性藏豬［體重：（54．60±5．5．56 ）kg，樣品取自甘孜藏族自治州畜牧業科學研究所農業養殖基地］和雌性DLY豬（樣品取自成都市某屠宰場）各6頭，分別取背最長肌（LDM）和腰大肌（PMM）。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取

稱取40～50 mg肌肉組織研磨樣于1．5 ml離心管中，加入1 mL Trizol（Ambion） 充 分 裂 解 5 min， 隨后按照說明書內容進行RNA提取。使用 Nanodrop2000核酸蛋白儀（Thermo Scientific）對RNA質量和濃度進行檢測。

1.2.2 實時定量PCR檢測

分 別 使 用microRNA和mRNA 反 轉 試 劑 盒（TaKaRa）反 轉cDNA，qRT-PCR采 用SYBR Premix Ex Taq kit（TaKaRa）試劑在CFX96 實時熒光定量PCR檢測系統（Bio-Rad）下使用 2_ΔΔCt法進行檢測[8]，microRNA和mRNA分別使用U6和GAPDH作內參。相關引物序列見表1。

1.2.3 靶基因預測

miR-222靶基因預測使用TargetScan和miRDB軟件，同時結合序列分析比對的方式進行預測。

1.3 統計與分析

所有數值采用平均數±標準差表示，使用SPSS 20．0軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 miR-222在藏豬和DLY豬背最長肌及腰大肌中的表達

由圖1可知，miR-222在藏豬背最長肌中的表達量顯著（P＜0．05）高于腰大肌，miR-222在背最長肌的表達量是腰大肌的 1．40倍（圖 1．A）；miR-222在DLY豬背最長肌中的表達量顯著（P＜0．05）高于腰大肌，miR-222在背最長肌的表達量是腰大肌的 1．51 倍（圖 1．B）。

圖1 miR-222在藏豬和DLY豬背最長肌（LDM）和腰大肌（PMM）中的表達

圖2 miR-222與PGC1α結合序列圖示

表1 引物序列及反應溫度

2.2 miR-222靶基因PGC1α的序列分析

如圖2所示，miR-222的種子序列與PGC1α的3’UTR區域2239-3245位序列互補配對。

2.3 PGC1α在藏豬和DLY豬背最長肌和腰大肌中的表達

PGC1α在藏豬背最長肌中的表達量顯著（P＜0．05）低于腰大肌，為腰 大 肌 的 45．4%（ 圖 3．A）；PGC1α在DLY豬背最長肌中的表達量顯著（P＜0．05）低于腰大肌，為腰大肌的53．7%（圖 3．B）。

2.4 miR-222與PGC1α表達量的相關性分析

進一步對所有樣本miR-222和PGC1α的表達量進行線性相關性分析，如圖4。得相關性方程為：Y=-5458．1X+2．5594（Y ：PGC1α ；X ：miR-222）；R2=0．65；P＜ 0．05。

3 討論

骨骼肌的發育受到相關轉錄因子的嚴格調控，microRNA參與轉錄后調控機制也影響著骨骼肌的發育。當前研究表明一些肌源性microRNA（miR-1、miR-133和 miR-206）和非肌源性 microRNA（miR-378、miR-499、miR-152等）均在骨骼肌發育過程中扮演著重要角色[9-10]。此前已有研究發現miR-222可促進成肌細胞增殖，同時抑制其成肌分化[11]。但目前還未見miR-222在豬骨骼肌發育的相關研究報道，本試驗發現miR-222在成年豬骨骼肌中存在中等程度（U6表達量的0．2%～0．5%）的表達，提示可進一步對miR-222進行功能性研究。本試驗發現在藏豬和DLY豬中背最長肌miR-222表達水平均高于相同豬種的腰大肌，背最長肌是典型的白肌，腰大肌是典型的紅肌，miR-222在兩個豬種中具有相同的表達模式，暗示miR-222可能參與了豬骨骼肌類型的轉換和調控[12]。同時研究還發現DLY豬背最長肌和腰大肌中miR-222表達水平均低于藏豬，藏豬是典型的地方品種豬，生長速度和骨骼肌發達程度均不如DLY豬[13]。miR-222在骨骼肌更發達的DLY豬種中具有更低的表達模式也暗示了其可能參與骨骼肌發育調控，與此前在小鼠上的研究吻合[7，11]。

鑒于miR-222在兩個豬種的腰大肌中表達更低，我們猜測miR-222可能參與了骨骼肌肌纖維類型和能量代謝的調控。而microRNA調控是一種經典的表觀遺傳調控，其功能的發揮必須依靠其靶基因執行。過氧化物酶體增殖激活受體γ輔助激活因子α(PGC1α)是一種轉錄輔助激活因子，在線粒體含量豐富和氧化代謝活躍的組織中高表達[14-15]。通過軟件預測和序列比對我們發現PGC1α的3’UTR區域存在miR-222種子序列的結合位點，暗示PGC1α可能是miR-222的潛在靶基因。進一步我們檢測了藏豬和DLY豬背最長肌和腰大肌PGC1α的表達，發現在藏豬和DLY豬背最長肌中PGC1α的表達量均低于相同豬種腰大肌，與miR-222表達模式相反，且與此前相關研究結果相似[16]。進一步對PGC1α和miR-222的表達量進行相關性分析，發現PGC1α與miR-222存在顯著強負相關，進一步提示PGC1α和miR-222的靶標關系。

圖3 PGC1α在藏豬和DLY豬背最長肌（LDM）和腰大肌（PMM）中的表達

圖4 miR-222與PGC1α表達量的相關性分析

4 結論

miR-222在藏豬和DLY豬的背最長肌中表達量高于腰大肌，其潛在靶基因PGC1α在藏豬和DLY豬的背最長肌中表達量則低于腰大肌。暗示miR-222可能通過PGC1α參與了豬不同骨骼肌肌纖維發育的調控，但其靶標關系還有待進一步驗證。