POLD3在肝細胞癌中的表達及臨床病理意義分析

王娟 黃炳臣 吳雪銘 羅春英 蘇群英 黃永秩 陸海善 林潔 王超 黃小英 龍喜帶

【摘要】目的探討DNA聚合酶δ3（POLD3）在肝細胞癌（HCC）中的表達及臨床意義。方法通過免疫組織化學和實時定量多聚酶鏈反應檢測POLD3在134對HCC腫瘤組織與腫瘤旁組織樣本中的表達，通過實時定量多聚酶鏈反應和蛋白印跡法檢測SMCC-7721及QSG-7701中POLD3的表達情況。結果（1）與腫瘤旁組織相比較，POLD3 mRNA及蛋白在HCC腫瘤組織中的表達減少，差異有統計學意義（P<0.05）；體外細胞學結果與之相一致。（2）POLD3表達與HCC腫瘤大小相關，POLD3表達水平越低者，具有更大的腫瘤直徑（P=0.017）。（3）POLD3表達與HCC腫瘤組織學分化程度相關，POLD3表達水平越高者，其腫瘤分化程度越高（P=0.001）。結論POLD3在HCC腫瘤組織中表達下調，并與腫瘤組織學分化程度及大小相關，這些結果提示POLD3表達可能促進HCC的發生與演進。

【關鍵詞】POLD3；肝細胞癌；表達；臨床病理意義

中圖分類號：R735.7文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.05.001

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinicopathological significance of DNA polymerase delta （POLD3） in hepatocellular carcinoma （HCC）.MethodsThe expression of POLD3 in 134 pairs of HCC tumor tissues and adjacent tissues were detected by immunohistochemistry and real-time quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）.And the expression of POLD3 in SMCC-7721 and QSG-7701 cells was analyzed by RT-qPCR and western-blotting assay.ResultsThe expression of POLD3 mRNA and protein in tumor tissues with HCC decreased while comparing with that in the peri-tumor tissue，and difference was statistically significant（P<0.05）.This decreasing POLD3 expression in tumor tissues was consistent with the results from in vitro analyses.（2） The expression of POLD3 was associated with tumor size，and the lower the level of POLD3 expression，the larger the tumor diameter（P=0.017）.（3）The expression of POLD3 was related to histological differentiation of tumor，and individuals with increasing expression level of POLD3，would have higher degree of tumor differentiation （P=0.001）.ConclusionThe expression of POLD3 is down-regulated in the tumor tissues of HCC and is related to the degree and size of histological differentiation，which suggests that the expression of POLD3 may promote the development and progression of HCC.

【Key words】POLD3；HCC；expression；clinicopathological significance

肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，該腫瘤的具體發病機制仍為當前生命科學研究的熱點問題[1～2]。近年來，研究發現DNA聚合酶δ3（DNA polymerase delta，POLD3）是一種重要的DNA修復基因，對維持基因組結構的穩定性是至關重要的，它的突變體和表達失調影響細胞分化、增殖、凋亡等生物學行為，涉及胃腺癌、結直腸癌、卵巢癌等多種腫瘤發生發展的過程[3～11]。然而，有關POLD3在肝癌中的表達及其臨床意義如何，至今為止國內外文獻報道甚少。

1材料與方法

1.1研究對象HCC研究對象入選標準如下：經病理診斷確診為HCC的患者、術前無放療與化療、具有完整的臨床病理資料、具有可供研究的合適組織樣本、患者本人同意參與本次研究。排除標準為：未經病理組織診斷確認者、術前具有放化療史者、資料不完整者、無可用于研究分析的合適樣本者、不同意參與者。根據以上標準，在2012年1月至2017年10月間共收集到134例符合要求的HCC研究對象，收集所有研究對象的石蠟組織標本用于POLD3蛋白表達分析；此外，我們也收集到12例新鮮組織樣本用于POLD3 mRNA表達分析。在本研究中，我們定義腫瘤組織為HCC癌組織，腫瘤旁組織為距離腫瘤邊緣5 cm處的肝組織。

1.2細胞系及細胞培養HCC細胞SMCC-7721和非HCC肝細胞QSG-7701均購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫，所有細胞均在含有5%胎牛血清的DMEM培養基中培養，培養環境為5% CO2氣體和37 ℃的恒溫環境。

1.3臨床標本收集根據前述研究對象的入選與排除標準，收集在右江民族醫學院附屬醫院住院符合要求的134例肝癌患者，按Edmondson-Steiner分級法（原發性肝癌診療規范，2017年版）進行分級：Ⅰ～Ⅱ級為高分化肝細胞性肝癌，98例；Ⅲ～Ⅳ級為中低分化肝細胞性肝癌，36例。

1.4POLD3蛋白表達水平的檢測分別使用免疫組織化學法及蛋白印跡法檢測組織樣本與細胞樣本中的POLD3蛋白表達水平，POLD3抗體購自Santa Cruz生物科技公司，所有實驗均設立陽性與陰性對照，按照標準操作流程完成，結果經高年資病理醫師確認。POLD3蛋白的陽性定位于細胞核或細胞漿，以有明顯的棕色顆粒作為陽性的判定標準，具體的判定方法見參考文獻[12]。

1.5POLD3 mRNA表達水平的檢測按照已報道的實時熒光定量PCR技術檢測新鮮組織樣本和體外培養的細胞樣本中的POLD3 mRNA表達水平[3]，在本研究，我們以ACT作為內參，采用2-△△定量法線性化分析POLD3 mRNA的相對表達水平。

1.6統計學方法所有數據均采用SPSS 23.0軟件進行處理，采用t檢驗或χ2檢驗比較組間差異，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2結果

2.1POLD3蛋白在HCC的表達情況免疫組織化學檢測結果顯示：與腫瘤組織相比，POLD3蛋白在HCC腫瘤旁組織中具有更高的表達，差異有統計學意義。見圖1A和1B，表1。體外細胞學實驗結果也顯示癌細胞中的POLD3蛋白水平下調，差異有統計學意義。見圖1C。

2.2POLD3 mRNA在HCC組織中的表達我們通過RT-qPCR技術檢測了12例新鮮HCC組織中POLD3 mRNA的表達情況，發現與腫瘤旁組織相比，腫瘤組織中的POLD3 mRNA表達水平下降，二者差異有統計學意義（P<0.001）。見表2。體外細胞學分析有類似發現。見表3。

2.3POLD3表達與HCC臨床病理特征的關系POLD3與HCC組織學分化程度、腫瘤直徑大小之間的差異均有統計學意義（P<0.05），與其他病理特征的差異均無統計學意義（P>0.05）。見表4。

3討論

POLD3作為POLD的第三個亞基，在各項生命活動中起到DNA修復的作用，在染色體復制過程中同樣起到重要的作用，其功能一直被研究者關注著。POLD3能穩定POLD1-POLD2的相互調節作用，并且通過C-終端PIP盒便于POLD復合體與PCNA的相互調節作用、參與跨損傷合成及DNA甲基化的進程[13～20]。Hirota K等[21]研究表明，POLD3有助于跨損傷合成在復制叉上操作或關閉復制叉的作用，但在后復制間隙填充的作用不明顯。Murga M等[22]發現POLD3在RS誘導DNA修復過程中的DNA合成具有獨特的作用，且通過細胞學實驗得到POLD3缺陷導致復制應激和細胞死亡。Zhou Z等[23]發現POLD3在小鼠胚胎干細胞和精母細胞的DNA雙鏈斷裂（DNA double strand breaks，DSB）修復、端粒維持和基因組穩定性中都起著重要作用。西班牙國家癌癥研究中心的研究人員發現了POLD3在DNA復制過程中的關鍵作用，沒有POLD3的細胞不分裂，細胞就會死亡，甚至是胚胎發育的過程和新生物體的誕生都可能被削減；沒有POLD3的細胞就會喪失復制基因組的能力而發生死亡。對于這種現象不僅存在于腫瘤細胞，正常的細胞也是如此，但是POLD3在正常細胞有多大程度的作用是至關重要的，目前對于POLD3在正常細胞的這種功能尚不是很清楚。

近幾年，學者發現POLD3與腫瘤的形成有著密切聯系，其調控異常可能導致癌細胞惡性分化、增殖。陸茵茵等[3]發現POLD3在胃腺癌中表達下調，且這種表達下調與腫瘤分化、增殖及預后不良相關。Dunlop等[4]通過大樣本病例對照實驗發現POLD3的基因其中一個位點的突變體與大腸癌的發生相關，且POLD3在該位點突變后形成的突變體能夠增加結直腸癌的發病風險，然而他們并沒有探討POLD3在結直腸癌中的表達情況及分析其與臨床病理參數是否存在一定的關系。Willis等[5]采用meta分析眾多卵巢癌中POLD3的表達情況，結果發現在預后不良的卵巢癌患者中POLD3表達減少。

為了探討POLD3與肝癌臨床病理特征之間是否存在一定的關系，我們從肝癌組織和肝癌細胞株兩個方面進行了研究；在臨床上我們通過一系列的篩選標準最后收集134對符合要求的標本。本課題一方面通過IHC、WB技術檢測肝癌腫瘤組織、癌旁組織、肝癌細胞株及肝細胞株中POLD3蛋白的表達情況，另一方面通過RT-qPCR技術檢測12例新鮮肝組織、人肝癌細胞株SMCC-7721及人肝細胞株QSG-7701中POLD3mRNA的表達情況。通過研究我們發現POLD3在肝癌組織和肝癌細胞中表達下調，這種異常表達既出現在蛋白水平，也出現在mRNA水平上。我們得到的實驗結果：肝癌組織學分化程度越高，POLD3的表達越高；肝癌直徑越大，POLD3的表達越低，暗示著POLD3與肝癌的分化、增殖相關。這一點與以上學者所得到的研究結果相一致，我們猜測干擾POLD3基因的突變可以抑制肝癌的惡性分化、增殖，這也許對于肝癌及其相關腫瘤是一種有重要價值的研究結果。

因此，不管是從正常的生命活動還是從腫瘤形成的過程，進一步探討POLD3基因的調控機制與腫瘤之間的關系，這將為腫瘤治療提供新的選擇，為未來靶點治療提供新的思路。

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（收稿日期：2018-09-06修回日期：2018-10-16）

（編輯：潘明志）