一株真菌對銅離子的耐受性初步研究及鑒定

鄭愛芳

摘 要：用含有不同銅離子濃度的PDA平板培養菌株XLS，通過測菌落直徑檢測菌株的耐銅性，對菌株進行分子生物學鑒定。結果顯示：當銅離子濃度為20mg·L-1時，菌落直徑最大，為88.54mm，菌絲最濃密，說明在該濃度時銅離子能促進菌株XLS的生長，但效果不顯著；濃度≥80mg·L-1時，菌落直徑呈遞減趨勢；銅離子濃度為80mg·L-1時，菌落生長略微受到抑制；當銅離子濃度提高到200mg·L-1時，菌落直徑下降明顯，濃度為300mg·L-1時菌落直徑僅為20.14mm，400mg·L-1時菌株生長完全受到抑制，該菌株對銅的最大耐受濃度≤400mg·L-1，抗銅性較強。將該序列提交到GenBank（Accession No：KY889145），根據Blast比對結果，將其初步鑒定為Nigrospora sphaerica，即球黑孢菌。

關鍵詞：真菌；重金屬污染；銅離子；球黑孢菌

中圖分類號 X172 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）21-0044-03

Identification and Growth Tolerance Characteristic of a Fungi Strain to Copper Ion

Zheng Aifang

（College of Life Science，Anqing Normal University，Anqing 246133，China）

Abstract：Growth tolerance characteristicf the fungi strain to copper ion was detected by culturing the fungi strain XLS on the PDA plate with different Cu2+ concentrations and measuring the colony diameter.The strain XLS was identified by molecular biology methods.The results showed that colony diameter was was 88.54 mm，its the biggest，when the concentration of Cu2+ was 20mg·L-1，the hyphae were dense，Cu2+ had positive effect on the growth of the stain，but the effect was not significant .Cu2+concentration above 80mg L-1，colony diameter had a descending trend.The hyphae growth was slightly inhibited at 80mg·L-1，colony diameter decreased more signifi-cantly at 200mg·L-1 and was only 20.14 mm at 300mg·L-1，the hyphae growth was completely inhibited at 400mg·L-1.The ITS sequence was submitted to GenBank （Accession NoKY889145）and the results showed that the strain XLS had a high similarity to Nigrospora sphaerica.

Key words：Fungi；Heavy metal pollutio；Cu2+；Nigrospora sphaerica

隨著工業化的發展，重金屬污染日趨嚴重，在對空氣、水體造成污染的同時，成為一種難處理的土壤和水體污染物。礦產資源在開采過程中會造成礦區附近土壤和水質的重金屬污染，給人們身體健康帶來了嚴重威脅[1，2]。為保護耕地和水資源，很多學者對重金屬造成的水體和土壤污染修復進行了大量研究。土壤重金屬污染的修復方法包括物理法、化學法、生物法及聯合法[3]，物理和化學方法費用高、能耗大且容易造成二次污染[4-6]，因此生物處理方法成為了國內外研究的熱點。當前，國內外對金屬離子的生物吸附利用的吸附劑有細菌、絲狀真菌、酵母和藻類及大型真菌的子實體或菌絲體[7，8]，其中利用真菌處理重金屬污染成為了重要的研究方向。真菌能將大量重金屬以礦化的形式從污水或土壤中分離出來，分離出來的重金屬能夠作為資源進行回用[9]，也避免了環境污染原位修復時重金屬鹽被再度活化的問題。本研究利用皖西南豐富的真菌資源，分離篩選具有強吸附銅離子能力的菌株，用以修復水體及土壤中銅離子的重金屬污染，降低對人們健康的危害和影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實驗室保存的XLS菌株。

1.1.2 培養基 PDA培養基：馬鈴薯200g·L-1，葡萄糖20g·L-1，瓊脂20g·L-1；重金屬母液：濃度為2000mg·L-1、20000mg·L-1的硫酸銅母液。

1.3 菌株XLS耐銅性實驗[10]

1.3.1 活化菌種 用PDA平板活化冰箱中保存的菌種，待菌落長滿平板后置于冰箱備用。

1.3.2 制備含有不同銅離子濃度的平板 將銅離子母液過濾除菌，無菌條件下分別量取0、1、2、3、4mL的濃度為2000mg·L-1的銅離子母液，加入到裝有100、99、98、97、96、95mL無菌PDA（60℃左右）培養基的三角瓶中，倒平板，制成含有硫酸銅濃度分別為0、20、40、60、80、100mg·L-1的固體平板；取0.5、1、1.5、2、2.5、3mL濃度為20000mg·L-1的硫酸銅母液，加入到裝有99、98.5、98、97.5、97、mL無菌PDA（60℃左右）培養基中，倒平板，制成含有銅離子濃度分別為100、200、300、400、500、600mg·L-1的固體平板。

1.3.3 接種及檢測 用打孔器在平板菌種的菌絲前端打取直徑為6mm的菌絲塊，將有菌絲的一面朝下，置于直徑為9cm的含銅PDA平板的中央，每個濃度做3個重復。將接菌的平板置于28℃條件下避光培養，待其中1個平板長滿菌絲后停止培養，垂直方向測定菌落的直徑，取兩者的均值。

1.4 基因組DNA的提取及分子生物學鑒定 收集菌株XLS菌絲，用試劑盒提取DNA。ITS基因PCR擴增：擴增引物序列為ITS1F：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反應體系（50μL）：10×PCR Buffer（withoutmg2+：100mM Tris-HCl pH 8.8 at 25℃；500 mM KCl，0.8%（v/v）Nonidet）5μL；dNTP（10 mM）1μL 、引物各1μL 、MgCl2（25mM）5μL、Taq酶（5U/μL）5μL，模板DNA1μL、ddH2O 35.5μL。PCR反應條件：95℃變性3min；95℃變性20s，56℃退火20s，72℃延伸50s，共35個循環，72℃延伸5min，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。PCR產物純化用回收試劑盒（Axygen）回收，由上海凌恩生物科技有限公司測序。序列與NCBI網站上核酸數據庫進行基因序列比對，對菌株進行初步鑒定。

2 結果與分析

2.1 菌株XLS耐銅性分析 從圖1可以看出，菌株XLS菌落大小隨著銅離子濃度的增加而減小，其菌落直徑值見表1。當銅離子濃度為0～60mg·L-1時，菌株XLS菌落直徑變化不大；濃度為20mg·L-1時菌落最大，菌落直徑為88.54mm，菌絲最濃密，說明在該濃度的銅離子能促進該菌株的生長，但效果不顯著；銅離子濃度高于60mg·L-1，菌落直徑呈遞減趨勢，銅離子濃度為80mg·L-1時菌落生長略微受到抑制；當銅離子濃度提高到200mg·L-1時，菌落直徑下降明顯，菌落直徑為52.88mm，縮小40%；濃度為300mg·L-1時菌落直徑僅為20.14mm，400mg·L-1時菌株受到完全抑制，說明該菌株對銅的最大耐受濃度在300～400mg·L-1。

2.2 菌株XLS的鑒定 用真菌通用引物ITS1F和ITS4R引物對真菌XLS菌株進行PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳后顯示該菌株的PCR產物條帶位于500～600bp（圖2），該ITS 序列為545bp，將該序列提交到GenBank（Accession No：KY889145），進行Blast，結果顯示：菌株XLS與GenBank 中Nigrospora sphaerica（GQ851731.1，KJ76712 1.1，KX271308.1，GQ851722.1，GQ919076.1）5個菌株的ITS序列覆蓋度在100%，相似性達到99%。根據此分子生物學特性，將其初步鑒定為Nigrospora sphaerica，即球黑孢菌。

3 結論與討論

菌株XLS經鑒定為Nigrospora sphaerica，即球黑孢菌，能夠在含有高濃度的銅離子培養基中生長，銅離子濃度20mg·L-1時對菌株生長有促進作用，效果不明顯。銅離子濃度超過80mg·L-1時，菌株生長受抑制，200mg·L-1時抑制效果顯著，菌落直徑耐受最高銅離子濃度為300mg·L-1，超過400mg·L-1生長受到完全抑制。菌株XLS對高濃度銅離子有較強的耐受性，具有作為吸附劑處理銅離子造成的水污染的潛力。

目前還未有利用球黑孢菌處理銅離子污染的研究報導，后續將進一步研究該菌株處理銅離子廢水的影響因素，優化最佳條件，如：菌絲球投加量、pH、溫度、轉速、初始銅離子濃度、吸附時間等因素對該菌株在液體條件下生物吸附Cu2+ 的影響，為其進一步應用提供實驗依據。

參考文獻

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（責編：張宏民）