百子蓮體細胞發育受體激酶APSERK1（Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1）基因全長克隆及表達分析

張琰 石玉波

摘 要：根據前期百子蓮（Agapanthus praecox ssp.orientalis）轉錄組測序分析的結果，獲得了1個與胚性能力相關的關鍵基因Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1（SERK1）同源性較高的核心片段。采用cDNA末端快速擴增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）方法得到了百子蓮SERK基因cDNA全長序列，命名為ApSERK1。序列分析表明，百子蓮ApSERK1基因開放閱讀框（ORF）為1800bp，編碼1個含有600個氨基酸的蛋白質。氨基酸同源性比對發現，百子蓮ApSERK1蛋白序列與水稻、小蘭嶼蝴蝶蘭、鐵皮石斛、椰子樹和菠蘿等植物蛋白序列的相似性可達到90%以上。實時熒光定量qRT-PCR結果表明，ApSERK1基因有一定時空表達差異，在百子蓮的種子、小花梗中表達含量最高，且隨著外源生長素濃度的增加，胚性愈傷組織的胚性能力呈現下降趨勢。推測ApSERK1基因是衡量植物細胞胚性能力的重要指標。

關鍵詞：百子蓮；體細胞發育受體激酶；基因克隆；表達分析

中圖分類號 S682.32 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）21-0036-05

Molecular Cloning and Expression Analysis of Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1 in Agapanthus praecox

Zhang Yan et al.

（1Shanghai Vocational Technical College of Agriculture and Forestry，Shanghai 201600，China）

Abstract：A core fragment highly homologous with the key gene of embryo ability pathway， Somatic Embryogenesis Receptor Kinase1（SERK1 was obtained on the basis of preliminary Agapanthus praecox ssp. orientalis transcriptome sequencingresults. The full length sequence of cDNA， the SERK1 gene of A. praecox was gained by the RACE method， which was named ApSERK1 . The results of sequence analysis showed that the full length of cDNA was 1800bp， which was composed of 600 encoded amino acids.The amino acid homology comparison found that the ApSERK1 protein sequence of baizilian could be more than 90% similar to the plant protein sequences of rice， xiaolangyu butterfly orchid， dendrobium candidum， coconut tree and pineapple.The results of real-time quantitative PCR showed that ApSERK1 gene had a certain temporal and spatial expression difference， with the highest expression content in the seed and floret stalk， and the germinal capacity of embryonal callus decreased with the increase of exogenous auxin concentration.It is speculated that ApSERK1 gene is an important indicator of the embryonic ability of plant cells.

Key words：Agapanthus praecox ssp. orientalis；Somatic cell Receptor kinase；Gene cloning；Expression analysis

基于德國植物生理學家Haberlandt（1902）提出的細胞全能性（Cell Totipotency）理論[1]，植物體細胞胚胎發生（Somatic Embryogenesis，SE）是指在離體培養條件下，單倍體或雙倍體的體細胞向類似合子胚的體細胞胚胎（Somatic Embryos）發生方式轉變，并發育成新個體的形態發生過程[2]。自從1958 年英國生物學家F.C.Steward和J.Reinert分別以胡蘿卜的根系作為外植體成功誘導出體細胞再生植株以來[3]，目前在裸子植物、雙子葉植物、單子葉植物中已有300多種植物利用其莖段、下胚軸、子葉、葉片、葉柄、果肉、花芽、根、合子胚、胚乳等作為外植體建立了SE 技術體系[4]。體細胞發育受體激酶 SERK（Somatic Embryogenesis Recepotor Kinase）基因無疑是檢驗植物體細胞體系建立的1個關鍵性基因。1997年Schmidt等首先從胡蘿卜懸浮胚性細胞中檢測出DcSERK基因的差異表達，并將其作為胚性能力檢驗的首要分子標記物[5]。Hecht等（2008）也從擬南芥中克隆了定位于亞細胞的膜蛋白基因AtSERK1～ AtSERK5，推斷SERK在某個節點上與SE激素信號通路之間相互作用[6]。

百子蓮（Agapanthus praecox ssp. orientalis）又稱藍百合，為百子蓮科百子蓮屬的單子葉多年生球根花卉，原產于非洲南部的熱帶與亞熱帶地區。百子蓮屬植物花序碩大、花色優雅、株形整齊，觀賞性很強，是國外植物造景中常用的植物資源。我國最早于2002年將百子蓮引入上海，研究中發現其花芽分化時受到溫度影響結實率很低[7]，因此建立了百子蓮體細胞培養體系（Somatic Embryogenesis，EC）[8]。SERK作為體細胞胚胎發育的關鍵基因，在單子葉植物百子蓮及其體細胞發育的研究中還沒有報道。筆者克隆得到了百子蓮體細胞受體激酶APSERK1，并利用實時熒光定量分析的方法，對百子蓮不同發育時期各組織、不同體細胞中的APSERK1進行了相對定量表達分析，為進一步了解SERK在百子蓮體細胞發育過程中的表達模式和作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗材料為2002年由南非引入我國上海地區的百子蓮（Agapanthus praecox ssp.orientalis），取百子蓮胚性愈傷組織（EC）提取總RNA，進行cDNA的RACE擴增。

1.2 實驗方法

1.2.1 cDNA核心序列的獲得 根據前期百子蓮轉錄組測序分析結果，得到百子蓮SERK（1749bp）同源基因的核心序列，使用Primer5軟件設計引物3-GSP1和3-GSP2、5-GSP1和5-GSP2。以百子蓮胚性愈傷組織（EC）的cDNA為模板進行目的片段擴增，引物序列見表1。反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s、60～65℃退火30s、72℃延伸30～90s（視產物片段大小而定），35個循環；72℃保持5min，使產物延伸完整。反應程序結束后，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（120V，30min），觀察條帶位置與亮度，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行膠回收。

1.2.2 SERK基因全長克隆 以提取百子蓮胚性愈傷組織的總RNA為模板，采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）擴增試劑盒進行3′RACE和5′RACE cDNA文庫的構建。以SERK-F1、UPM和SERK-R1、UPM作為3′ RACE和5′RACE擴增的第1輪引物，根據獲得的目的片段序列，使用Primer 5軟件設計3′RACE巢式PCR引物SERK-F2和SERK-F3，以百子蓮3′RACE cDNA文庫（1μL）為模板，按SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）擴增試劑盒說明書進行操作，獲得3′端序列。將獲取的目的片段序列和3′ RACE序列拼接后，設計5′RACE巢式PCR引物SERK-R2，按上述擴增試劑盒說明書操作，獲得5′端序列。將3′端序列、中間目的片段序列和5′端序列拼接后，設計SERK基因全長特異性引物SERK-F1和SERK-R3，通過PCR擴增，克隆、測序，獲得該基因全長序列。

1.2.3 生物信息學分析 利用NCBI網站上的BLASTx程序進行序列相似性分析；使用GenBank ORFfinder和在線網站（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）進行開放閱讀框的預測以及蛋白1級結構（理論等電點和分子量）的分析；應用DNAman軟件進行同源性比較分析；利用瑞士模型預測網站（http：//swissmodel.expasy.org/）進行蛋白3級結構預測分析。

1.2.4 熒光定量PCR 通過實時熒光定量qRT-PCR方法分析SERK在不同發育階段、不同組織中的表達情況。使用Beacon Designer 7軟件設計qRT-PCR引物qSERK-F和qSERK-R。利用FTC-3000TMSYSTEM實時熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR反應，反應體系為：SYBR Premix Ex Taq II（2X）10μL、primer（10μm）各0.5μL、cDNA 2.0μL、RNase-free H2O up to 20μL。反應程序設置94℃預變性60s；94℃變性10s，56℃退火15s，72℃延伸25s，共40個循環。反應完成后計算平均值和標準差，采用2-ΔΔCt法[9]進行數據分析，所用百子蓮內參基因為Actin。所有樣品重復3次。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取與APSERK1基因核心片段的獲得 RNA的質量是決定基因克隆成敗的關鍵，高純度完整的RNA是基因克隆的基礎和保障。以百子蓮胚性愈傷組織作為試驗材料，進行RNA的提取，并反轉錄為cDNA，以期望得到較為全面的轉錄信息。試驗選用上海英濰捷基生物技術有限公司的Trizol試劑提取百子蓮總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，28s、18s和5s條帶清晰，且28s、18s條帶之間無明顯彌散現象，28s是18s亮度的2倍左右，表明提取的總RNA樣品較完整，無明顯降解現象（圖1a）。用Thermo NanoDrop1000 微量紫外分光光度計測量A260/A280 比值為2.07，比值在2.0左右；A260/A230 比值分別為2.24，比值大于2，濃度為1562.0ng/μL，說明此方法提取的RNA樣品純度較高，可用于繼續開展后續試驗。

根據百子蓮轉錄組測序結果，得到了百子蓮ApSERK1基因片段762 bp，根據已知序列設計1組引物進行PCR擴增，經PCR擴增，得到單一目的條帶的產物。序列經BLASTp分析表明，該片段與多種植物的SERK基因具有很高的同源性，推定其為百子蓮APSERK1基因片段（圖1b）。在此基礎上，根據確定的目的片段分別進行后續的3，5RACE。

2.2 APSERK1基因的全長序列獲得 通過3′RACE第2輪和第3輪巢式PCR分別獲得1081bp和885bp（圖2）的cDNA片段，拼接后得到3′RACE945bp的cDNA片段。5′RACE經兩輪巢式PCR后獲得1814bp（圖3）的cDNA片段，將3′RACE序列、核心序列和5′RACE獲得的序列進行比對拼接后，得到2332bp的SERKcDNA全長序列，其中A、T、G、C4種堿基含量分別為26.8%（A）、28.47%（T）、24.5%（G）和20.15%（C）。經NCBI的ORF Finder分析，ApSERK1基因開放閱讀框（ORF）為1800bp，編碼1個含有600個氨基酸的蛋白質（圖4）。

2.3 APSERK1氨基酸序列分析 運用Protparam網站對百子蓮ApSERK1進行了相關理化性質分析，推斷出ApSERK1蛋白質相對分子量為160.59kD，等電點（pI）為4.94。對預測的ApSERK1蛋白序列2級結構預測分析發現，ApSERK1中含有52.54%的ɑ-螺旋、30.14%的無規則卷曲、3.21%的β-轉角和14.11%的延伸鏈。圖5所示為百子蓮ApSERK1蛋白序列的3級網絡結構。

2.4 APSERK1的同源性比較 運用NCBI網站上的BLASTx軟件對ApSERK1進行同源性序列比對，并用DNAman軟件進行其氨基酸序列同源性比較分析結果表明，百子蓮ApSERK1蛋白序列與其他植物的體細胞受體激酶具有非常高的相似性，與水稻（XP_015649858.1）、小蘭嶼蝴蝶蘭（XP_020586612.1）、鐵皮石斛（NP_020698803.1）、椰子樹（AAV58833.2）和菠蘿（XP_020081964.1）等植物蛋白序列的相似性可達到90%以上（圖6）。

受體激酶的多序列比對（陰影部分為完全相同的氨基酸）

2.5 APSERK1的空間表達分析 采用實時熒光定量PCR對百子蓮根、莖、葉片、花葶、花器官、種子等不同器官中ApSERK1基因的表達進行了分析。結果顯示，百子蓮成熟種子中ApSERK1表達量最高，分別是小花梗、花瓣、子房、花藥、根、老葉、新葉、花絲、莖和花葶的1.88、2.24、3.06、3.48、3.51、4.40、4.97、5.73、6.58和7.62倍；表明在各器官中，百子蓮成熟種子的胚性能力最強，其次是花器官，最后是根與葉；在花器官中，以小花梗中的ApSERK1表達量最高，分別是花瓣、子房和花藥的1.19、1.62、1.85倍（圖7）。

進一步對不同濃度毒莠定（PIC）處理下的百子蓮的胚性愈傷組織進行了PCR檢測，分析得出PIC1.0濃度處理的胚性愈傷組織中的ApSERK1表達量最高，分別是1.5濃度、2.0濃度處理的1.6和4倍，表明隨著外源生長素濃度的增加，胚性愈傷組織的胚性能力呈現下降趨勢（圖8）。

3 結論與討論

從百子蓮中克隆得到SERK同源基因DNA全長序列，并命名為ApSERK1。ApSERK1基因開放閱讀框（ORF）為1800bp，編碼1個含有600個氨基酸的蛋白質，運用生物信息學BLASTx軟件對ApSERK1進行同源性序列比對分析結果顯示，其與水稻、蝴蝶蘭、鐵皮石斛等單子葉植物中已經分離的SERK基因有非常高的同源性。目前已經在馬尾松[10]、挪威云杉[11，12]、白云杉[13，14]、日本落葉松[15]、墨西哥垂松[16]、火炬松[17]、輻射松[18]、川西云杉[19]等裸子植物和水稻[20]、紫花苜蓿[21-22]、菊苣[23]、香石竹[24]、矮牽牛[25]、唐菖蒲[26]、仙客來[27]、棉花[28]、大豆[28]、龍眼[29]等被子植物上克隆得到了SERK的同源基因。其中很多植物中都已經證明SERK受體激酶不僅是胚性能力的體現，同時參與了油菜素內酯代謝與合成途徑，生長素反應與油菜素內酯反應所涉及的基因具有重疊性，通常生長素抑制的基因也能被油菜素內酯所抑制，表明兩者的信號通道有著某種聯系，而植物想要保持胚性必須運用外源的各類生長素進行誘導和調節[30]。

通過實時熒光定量分析可以看出，ApSERK1基因有一定時空表達差異，在百子蓮不同組織器官中都有表達，在種子、小花梗中表達含量最高，且隨著外源生長素濃度的增加，胚性愈傷組織的胚性能力呈現下降趨勢。范現麗在2009年建立了百子蓮的體細胞培養體系，其中分別用了百子蓮的根、花葶、葉以及各花器官做了誘導實驗，無論是在愈傷組織誘導階段還是在胚性愈傷組織誘導階段，百子蓮的小花梗始終是誘導材料的首選[8]。雖然百子蓮的種子是胚性最強的器官，但由于其在上海地區結實率很低[7]，主要依靠國外進口，因此百子蓮的小花梗依舊是其誘導體細胞的最佳選擇。研究中推測ApSERK1基因也是具有生物功能的SERK類似基因，具體怎樣調節百子蓮的體細胞使其保持胚性，還需要做進一步深入研究。

結合前期研究結果，百子蓮ApSERK1全長cDNA的成功克隆對進一步探討其表達調控特征和分析表達產物的生化特性提供了理論依據，為在分子水平上研究百子蓮體細胞胚性保持與胚性喪失等方面的嘗試奠定了基礎，此研究對深入探討百子蓮胚性保持機制，揭示植物激素信號轉導路徑等方面具有重要的意義。

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（責編：徐世紅）