兒童氨基糖苷類藥物性耳聾基因快速無創檢測法的應用

張瓊敏，李斯斯，陳君，朱翌

（1.溫州醫科大學附屬第一醫院 耳鼻咽喉科，浙江 溫州 325015；2.深圳大學總醫院 耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518000）

耳聾是困擾人類健康的一種常見疾病。全世界范圍內每1 000名嬰兒出生就有1～3名聾兒誕生[1]。根據2006年中國殘疾人調查統計數據顯示，我國聽力言語殘疾者已達2 780萬，其中聽力障礙兒童約13.9萬，并且每年新生聾兒約3萬人[2]。耳聾是兒童語言形成和發展的巨大障礙，嚴重影響了患兒身心健康發育。因此，在嬰幼兒聽力篩查的基礎上開展耳聾基因檢測來防治耳聾是至關重要的。遺傳和環境是引起耳聾的兩大主要因素[3]。80%的患者除耳聾外不伴有其他癥狀，稱為非綜合征型耳聾[4]。氨基糖苷類藥物性耳聾是一種由氨基糖苷類抗生素如鏈霉素、慶大霉素引起的常見的非綜合征型遺傳性耳聾[5]。線粒體12S rRNA基因位點A1555G和C1494T突變是導致該類藥物性耳聾最主要的遺傳性基礎。據文獻報道在嬰幼兒藥物性耳聾患者群體中這兩個突變位點的發生率約為11.5%[6]。該兩個位點的快速有效檢測對氨基糖苷類藥物性耳聾具有重要的防治意義。目前采集患兒靜脈血進行Sanger測序是檢測基因突變的金標準[7]。該法技術成熟，準確率極高，但費時費力，且血液采集是一項侵入式操作，對嬰幼兒造成一定程度的痛苦。為縮短檢測周期并減輕患兒痛苦，本研究嘗試采集患兒口腔黏膜拭子進行多重等位基因特異性PCR（multiplex allele-specific PCR，MAS-PCR）來檢測A1555G和C1494T的突變，探索一種更為快速、無創的藥物性耳聾基因檢測方法。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2015年5月至2017年5月溫州醫科大學附屬第一醫院耳鼻喉科門診診斷為非綜合征型感音神經性耳聾患兒共126例，男65例，女61例，年齡為2～15周歲。入選標準：經門診確診為非綜合征型耳聾、年齡在2～15歲的兒童患者；排除標準：①綜合征型耳聾患者；②有外耳及中耳先天性畸形及病變的患者（聲導抗及耳聲發射異常）；③有全身性疾病及傳染病的患者。每例患兒采集口腔黏膜拭子3根及靜脈血3 mL，并接受聽力學檢查包括聲導抗、耳聲發射、測聽[包括小兒電反應測聽（2～3周歲）、小兒行為測聽（3～6周歲）、純音測聽（6～15周歲）]等來判斷是否符合入選標準及評估聽力損傷程度。本研究經溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準，患兒監護人均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器：Universal Genomic DNA提取試劑盒、TakaRa ExTaq、TakaRa 100 bp plus marker DNA標記物、DMSO及質粒小量抽提盒；QIAamp DNA minikit（50）試劑盒購自德國QIAGEN生物公司，引物合成由大連寶生物工程有限公司完成，紫外分光光度計購自上海儀電科學儀器股份公司，PCR擴增儀購自美國BioRad公司，DYY-III-8B穩壓穩流電泳儀購自北京六一儀器廠，紫外凝膠系統購自美國SynGene公司。

1.2.2 口腔黏膜拭子的采集及口腔脫落黏膜細胞DNA的提取：取普通醫用棉簽在患兒口腔頰部刮拭黏膜10次，力度適中，采集拭子3根，干燥處理后置入標本袋保存。用QIAamp DNA minikit試劑盒進行口腔黏膜脫落細胞的DNA提取，并用紫外分光光度計檢測DNA的濃度及純度。

1.2.3 MAS-PCR：將提取的口腔黏膜脫落細胞中微量的DNA進行MAS-PCR反應，PCR反應引物設計參考文獻[8]。將引物分為2組：N組（C1、N1、N2、C2）和M組（C1、M1、M2、C2）。前者用于檢測野生型A1555G/C1494T；后者用于檢測突變型A1555G/C1494T。將微量DNA模板均分成2份，分別進行含N組引物的A管PCR反應和含M組引物的B管PCR反應。反應體系如下：總體積共25 μL，其中含50～100 ng DNA模板、8 pmol引物（M1、M2/Nl、N2）、4 pmol引物（Cl、C2）、1 U Taq酶、1.5 μL 4×d NTP（各0.0025 mol/L）、2.5 μL 10×PCR緩沖液、2.5 μL MgCl2（0.025 mol/L）、4 μL二甲基亞砜。PCR程序設定：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，63 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，10次循環（每次循環退火溫度較上一循環降低1 ℃）；94 ℃變性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35～40次循環；最后72 ℃延伸5 min。將最終得到的PCR產物在2%濃度的瓊脂糖凝膠中進行電泳，經溴化乙啶染色后用凝膠成像系統觀察并記錄結果。結果見表1。

表1 MAS-PCR瓊脂糖凝膠電泳結果（bp）

1.2.4 直接測序法檢測基因突變位點A1555G及C149AT：采集每位受檢患兒靜脈血3 mL，EDTA抗凝管保存，用Universal Genomic DNA提取試劑盒提取靜脈血中DNA，將獲得的DNA進行普通PCR擴增，將PCR產物送上海華大基因公司進行直接測序，測序結果用DNASTAR軟件分析比對并記錄結果。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統計分析。口腔黏膜拭子來源DNA濃度、純度與靜脈血來源DNA濃度、純度的比較采用兩獨立樣本t檢驗。口腔拭子來源DNA經MAS-PCR的檢出率與傳統金標準法檢出率的比較采用kappa一致性檢驗。當kappa≥0.75表示2種方法檢出率一致性較好；當kappa＜0.4表示兩者一致性較差；kappa在0.4與0.75之間時表示兩者一致性一般；P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2種樣本來源DNA濃度與純度的比較 口腔黏膜拭子來源DNA的濃度與靜脈血來源DNA濃度差異無統計學意義（P＜0.05）；口腔黏膜拭子來源DNA純度較靜脈血來源DNA小，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.2 快速檢測法檢測結果 口腔黏膜拭子來源DNA進行MAS-PCR后經瓊脂糖凝膠電泳快速診斷A1555G及C1494T突變情況（見圖1），本研究126例感音神經性耳聾患兒中檢測出A1555G突變者7例，C1494T突變者1例，檢出率為6.35%。

2.3 快速檢測法與傳統金標準檢測法檢測結果的比較 靜脈血來源DNA在通過傳統金標準方法得到的結果顯示：126例感音神經性耳聾患兒中檢測出A1555G突變者7例，C1494T突變者1例，測序比對結果見圖2，該法檢出率為6.35%。2種方法檢出率的一致性較好（kappa=1，P＜0.01），并且2種方法檢出的陽性標本為相同患者來源。

表2 口腔黏膜拭子來源DNA與靜脈血來源DNA濃度及純度的比較（

表2 口腔黏膜拭子來源DNA與靜脈血來源DNA濃度及純度的比較（

樣本來源 n DNA濃度（μg/mL）DNA純度（A260/A280）口腔黏膜拭子 126 50.6±23.4 1.70±0.15靜脈血 126 52.5±22.8 1.80±0.12 t-5.73 -4.58 P＜0.001 0.009

圖1 MAS-PCR檢測患兒藥物性耳聾基因突變電泳圖

圖2 氨基糖苷類藥物性耳聾患兒Sanger法基因測序結果

2.4 攜帶A1555G及C1494T位點突變患兒的臨床資料回顧分析 對8例陽性結果患兒臨床病史資料總結歸納后發現：7例攜帶A1555G突變患兒中，4例為男童，3例為女童；1例攜帶C1494T突變患兒為女童。他們均來自偏遠欠發達地區，出生時通過了聽力篩查，曾服用氨基糖苷類藥物如鏈霉素、慶大霉素等，均為感音神經性耳聾，雙耳聽力損傷程度為重度到極重度。

3 討論

隨著全面二孩政策的實施，新生兒數量的增加，我國新生聾兒的數量也日漸增多，防治耳聾的任務愈顯沉重。新生兒聽力篩查已在我國各大醫院普遍開展[9]。但一部分遺傳性耳聾具有遲發性或者在環境因素如藥物的影響下才出現[10]，單純的新生兒聽力篩查無法篩出這部分患兒，這使得耳聾基因檢測成為新生兒聽力篩查的必要補充手段[11]。近年，線粒體基因12S rRNA上A1555G及C1494T位點突變引起的藥物性耳聾成為研究熱點[12-14]。這兩個突變位點攜帶者在使用氨基糖苷類藥物后會出現不可逆轉的感音神經性耳聾[15]。如果對新生兒展開A1555G及C1494T位點的檢測可很大程度上避免該類耳聾的發生[16]，具有重大的防治意義。

目前臨床上對A1555G及C1494T位點的檢測主要是通過抽取患者靜脈血，經DNA提取及PCR后將產物送生物公司進行Sanger測序來完成。該法準確性極高，但周期長，費用高[17]。另外抽血是一項有侵入性的操作，對患者尤其是嬰幼兒造成了一定程度的痛苦。為了降低成本，減少痛苦，縮短檢測周期，本課題組致力于藥物性耳聾基因診斷中標本取材及檢測方法兩方面的探索。關于耳聾基因檢測方法，近幾年國內外在基因診斷技術方面不斷地探索，先后出現了聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性、熒光定量PCR、高效液相色譜分析、高分辨率熔點曲線分析、質譜技術、基因芯片技術等等[18]，各種不同的基因診斷技術各有其利弊。本課題組著眼于簡便、快速、經濟的優勢，在SCRIMSHAW等[19]的A1555G突變檢測方法和RODRíGUEZ-BALLESTEROS等[20]的C1494T突變檢測方法的基礎上建立了可同時檢測A1555G及C1494T突變位點的MAS-PCR技術，對靜脈血來源的DNA可快速準確地判斷A1555G及C1494T位點的突變情況。而本研究進一步嘗試將口腔黏膜拭子來源的DNA進行MAS-PCR，探索簡便、快速、無創的藥物性耳聾基因診斷方法。采集汗液、唾液、精液來獲得取微量DNA在法醫領域司空見慣[21-23]，臨床上采用口腔黏膜拭子提供DNA來作為常規檢測標本卻并不多見。然而一部分特殊群體如嬰幼兒、精神病患者等難以提供靜脈血，此時無創的口腔黏膜拭子便可提供另一途徑的標本取材[24]。人類口腔黏膜細胞為復層鱗狀上皮細胞，具有更新快、易脫落的特點，刮拭口腔頰黏膜可獲得大量脫落細胞。在本研究中單根口腔黏膜拭子大致可提供800～1 200 ng DNA量，大致與1 mL靜脈血所提取的DNA含量相當。而口腔黏膜拭子來源DNA的純度不及靜脈血DNA，這是由于人類口腔中定植了大量的細菌、病毒等微生物。由此可見，口腔黏膜拭子DNA具有量少，純度不高的特點。根據模板質量的不同MAS-PCR反應體系需調整其中的各影響因素及程序設定。比較前期已建立的MAS-PCR，本研究中以口腔黏膜拭子DNA為模板的PCR反應條件也隨之產生變化。在反應體系中，我們在濃度階梯式的試探后，適當地提高了引物濃度及DMSO濃度并降低了Taq酶、dNTP、及MgCl2的濃度。在程序設定中，我們增加了變性、退火、延伸的循環次數。反復多次調整后的MAS-PCR有了較高的特異性與穩定性，可較清晰地形成預判結果的條帶。MAS-PCR在數小時內便可提供氨基糖苷類藥物性耳聾相關位點A1555G及C1494T突變情況的診斷結果，較直接測序法大大地縮短了基因診斷周期，有著明顯的時間效率優勢。因此應用口腔黏膜拭子來源DNA進行多重等位基因特異性PCR可快速、無創、準確地檢測藥物性耳聾基因。

本研究對象為感音神經性耳聾的兒童患者，臨床資料顯示攜帶A1555G及C1494T突變位點的這部分患兒均有氨基糖苷類藥物如慶大霉素、鏈霉素的用藥史，而他們均通過了新生兒聽力篩查。本研究探索的通過MAS-PCR檢測口腔黏膜DNA藥物性耳聾基因突變位點的方法正是對新生兒聽力篩查的有力補充手段，對降低氨基糖苷類藥物性耳聾發病率具有十分重要意義。