妊娠期大鼠鎘暴露與妊娠高血壓疾病的關(guān)系

王繁，邱海凡，劉奕，陳璐璐，范風(fēng)云，王宗敏

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.產(chǎn)科；2.病理科）

鎘（Cadmium，Cd）是一種普遍存在的重金屬環(huán)境毒物。隨著工業(yè)化的進(jìn)展，更多的人暴露于鎘污染下[1]。鎘對(duì)腎臟、心血管系統(tǒng)等多種器官產(chǎn)生不良影響，生殖系統(tǒng)被認(rèn)為是鎘毒性作用最敏感的靶器官之一。妊娠狀態(tài)下由于部分微量元素相對(duì)缺乏，使腸道對(duì)鎘的吸收明顯增加，而導(dǎo)致孕婦體內(nèi)鎘蓄積較非妊娠時(shí)高[2]，而且妊娠期間母體和胎兒因生長(zhǎng)迅速和細(xì)胞分化而易受環(huán)境毒物的影響。鎘是否因而可以誘發(fā)孕鼠的妊娠高血壓疾病未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察不同濃度鎘劑量對(duì)孕期大鼠的血壓、蛋白尿等妊娠高血壓疾病臨床癥狀的影響以及胎盤(pán)、肝、腎等臟器病理改變，探討鎘對(duì)孕鼠的生殖毒性效應(yīng)及特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為普通級(jí)別SD大鼠，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究所，其中雌鼠10～12周齡，體質(zhì)量200～240 g；雄鼠12周齡左右，體質(zhì)量300～350 g。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都遵守國(guó)際和國(guó)家相關(guān)準(zhǔn)則，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用獲得同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前讓大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)用氯化鎘購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組和不同劑量染鎘實(shí)驗(yàn)：將確定妊娠的成年雌性SD大鼠隨機(jī)排序分為3組，對(duì)照組[n=6，體質(zhì)量（204.5±5.9）g]，0.25 mg/kg鎘處理組[n=7，體質(zhì)量（210.0±5.1）g]，0.5 mg/kg鎘處理組[n=8，體質(zhì)量（211.8±11.3）g]。鎘處理組從妊娠第4天開(kāi)始至妊娠第19天，每天上午給予孕鼠腹腔注射2 mL/kg相應(yīng)濃度的鎘。對(duì)照組腹腔注射2 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液。非孕組（n=6）在相同的時(shí)間以0.5 mg/kg的劑量腹腔注射鎘做對(duì)照。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期監(jiān)測(cè)大鼠體質(zhì)量，最后得到的氯化鎘最低劑量與最佳時(shí)間誘導(dǎo)大鼠妊娠高血壓疾病模型。

1.2.2 血壓測(cè)量：分別在交配前1周，以及妊娠的第4、第12、第19天上午9～11時(shí)，使用softron BP-98A型無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)，用尾套法檢測(cè)各組孕鼠尾動(dòng)脈的收縮壓，并以交配前最穩(wěn)定的血壓值作為每只大鼠的基礎(chǔ)血壓值。大鼠充分安靜后連續(xù)測(cè)量5次，取平均值。計(jì)算并比較各組妊娠第4、第12、第19天與基礎(chǔ)血壓的差值。非孕大鼠則在相應(yīng)的測(cè)量時(shí)間檢測(cè)收縮壓。

1.2.3 24 h尿蛋白量測(cè)定：在妊娠期的第3天和第19天，將孕鼠放置于代謝籠中，收集其24 h尿液標(biāo)本并記錄尿量，于室溫下2 000 r/min離心15 min，吸取其上清液，測(cè)量體積后保存于-80 ℃冰箱待檢測(cè)。采用BCA蛋白試劑盒檢測(cè)尿液標(biāo)本中尿蛋白的濃度，按照BCA蛋白分析試劑盒說(shuō)明書(shū)用A液和B液配制成工作液和標(biāo)準(zhǔn)液，然后用酶標(biāo)儀在562 nm測(cè)量OD值。在Excel表中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出孔的待測(cè)蛋白濃度，再乘以尿液的量，即為24 h尿蛋白量。計(jì)算并比較各組妊娠第3天與第19天尿蛋白的差值。

1.2.4 標(biāo)本收集：妊娠第20天麻醉大鼠后斷頭術(shù)處死大鼠打開(kāi)腹腔，計(jì)胎仔數(shù)，觀察肝、腎等臟器有無(wú)變化，迅速取出胎兒、胎盤(pán)、腎臟和腦組織并稱重。每只大鼠隨機(jī)選取3個(gè)胎盤(pán)、1個(gè)腎臟、肝臟、腦組織固定于10%的甲醛溶液，常規(guī)制片染色作組織學(xué)檢查。另取胎盤(pán)在0～4 ℃條件下迅速將組織切成1 mm3大小的組織塊，用2.5%的戊二醛固定，再放入用相同緩沖液配制的1%鋨酸中，于4 ℃固定2 h。然后常規(guī)超薄切片，電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。并另取胎盤(pán)及母鼠血，通過(guò)石墨爐原子吸收法測(cè)其鎘含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血和胎盤(pán)中鎘的濃度 0.5 mg/kg鎘處理組的孕鼠胎盤(pán)鎘的水平[（2.81±0.51）μg/g]明顯高于0.25 mg/kg鎘處理組[（1.03±0.30）μg/g]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。0.5 mg/kg鎘處理組孕鼠血中也檢測(cè)到（30.6±0.2）μg/L濃度的鎘。

2.2 孕鼠體質(zhì)量變化的比較 鎘染毒前，即妊娠第1天至第4天，各組孕鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差別。孕期0.5 mg/kg鎘處理組體質(zhì)量增長(zhǎng)最小，在妊娠第20天其體質(zhì)量值明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1A。

2.3 尾動(dòng)脈收縮壓差值的比較 各組間妊娠前、妊娠第4天大鼠尾動(dòng)脈收縮壓差值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。0.5 mg/kg鎘處理組在妊娠第12天收縮壓開(kāi)始升高，在妊娠第12天及第19天時(shí)其收縮壓升高值明顯大于對(duì)照組及非孕組（P＜0.05）。在妊娠第19天，0.25 mg/kg鎘處理組的孕鼠收縮壓升高值和非孕組比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.52）。見(jiàn)圖1B。

2.4 24 h尿蛋白含量差值的比較 妊娠第19天，0.5 mg/kg鎘處理組出現(xiàn)的妊娠相關(guān)性的24 h尿蛋白升高值高于對(duì)照組、非孕組和0.25 mg/kg鎘處理組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對(duì)照組和0.25 mg/kg鎘處理組的24 h尿蛋白升高值與非孕組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖1C。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量、收縮壓和24 h尿蛋白量比較

2.5 鎘誘導(dǎo)的孕鼠胎盤(pán)、腎臟、肝臟及腦組織的病理改變

2.5.1 肉眼觀察：對(duì)照組胎盤(pán)一般暗紅色，色澤均勻；而0.5 mg/kg鎘處理組胎盤(pán)大小變化不大，但個(gè)別胎盤(pán)周緣見(jiàn)褐色相間的鈣化帶。部分肝臟有少許粘連，顏色蒼白，部分大鼠出現(xiàn)輕度腹水。

2.5.2 組織學(xué)觀察：0.5 mg/kg鎘處理組孕鼠胎盤(pán)組織見(jiàn)絨毛水腫，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，并見(jiàn)凋亡細(xì)胞。迷路區(qū)血管壁增厚，細(xì)胞退行性變，廣泛纖維蛋白沉積。蛻膜組織空泡變性和腫脹，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。0.5 mg/kg鎘處理組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和間質(zhì)腎小動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄，部分腎小管管腔可見(jiàn)蛋白管型。亦見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。0.5 mg/kg鎘處理組肝竇淤血，肝細(xì)胞濁腫使肝索變窄，甚至出現(xiàn)局灶性壞死，匯管區(qū)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。0.5 mg/kg鎘處理組腦神經(jīng)細(xì)胞變性、細(xì)胞周和血管周間隙增寬，血管充血及灶區(qū)出血。見(jiàn)圖2。

2.6 電鏡觀察染鎘后胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化 0.5 mg/kg鎘處理組孕鼠胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少。線粒體腫脹，嵴模糊斷裂甚至融合消失，呈空泡狀，線粒體膜融合，可見(jiàn)髓樣化；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛擴(kuò)張，脫顆粒現(xiàn)象明顯；微絨毛數(shù)量減少，且排列紊亂甚至缺失；染色質(zhì)聚集成塊，核膜模糊。見(jiàn)圖3。

3 討論

近年來(lái)隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步及研究方法的不斷創(chuàng)新，對(duì)微量元素及其與妊娠高血壓疾病的關(guān)系認(rèn)識(shí)不斷深入，發(fā)現(xiàn)多種微量元素，包括鈣、鎂、鋅、硒的缺乏以及鎘、鉛的過(guò)量與妊娠高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[3]。鎘作為一種環(huán)境污染物，在人體內(nèi)蓄積，對(duì)肝臟、腎臟和生殖系統(tǒng)均造成危害[4-5]。急慢性鎘暴露可直接引發(fā)和導(dǎo)致高血壓[6]。

圖2 0.5 mg/kg鎘處理組和對(duì)照組孕鼠的胎盤(pán)、腎臟、肝臟及腦組織的HE染色結(jié)果

圖3 0.5 mg/kg鎘處理組孕鼠胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

關(guān)于鎘對(duì)孕鼠胚胎毒性影響的研究結(jié)果報(bào)道不一，一般實(shí)驗(yàn)研究多采用灌胃染毒或者腹腔注射的染毒方式[7]。本研究采用在妊娠第4～第19天每天腹腔注射不同濃度的氯化鎘（0.25、0.5 mg/kg）對(duì)SD孕鼠進(jìn)行染毒。平均每只大鼠每天0.05～0.1 mg，染毒總劑量為4～8 mg/kg。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.5 mg/kg鎘處理組的大鼠于妊娠第10～第13天血壓逐漸升高，并出現(xiàn)蛋白尿、胎鼠體質(zhì)量減輕等。病理檢查見(jiàn)胎盤(pán)血管充血，管壁增厚，纖維蛋白沉積，迷路區(qū)退化等。腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，間質(zhì)小動(dòng)脈壁增厚等。鎘暴露的孕鼠出現(xiàn)典型的妊娠高血壓疾病樣的臨床癥狀和病理改變。在妊娠高血壓疾病發(fā)病機(jī)制的研究中，動(dòng)物模型起著重要作用，有子宮胎盤(pán)缺血模型、炎癥模型、血容量增加模型等[8]。這些模型從不同方面重復(fù)出妊娠高血壓疾病的特點(diǎn)，而本研究成功地用重金屬鎘建立了妊娠高血壓疾病的動(dòng)物模型。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)孕鼠注射0.5 mg/kg鎘8 d后即出現(xiàn)血壓升高。該劑量對(duì)于非孕組大鼠注射14 d后血壓相對(duì)于給藥前呈輕度升高，同樣劑量孕鼠平均增加的血壓和增加的尿蛋白量和非孕組相比均有顯著性差異。故在本研究中不管是血壓還是尿蛋白，孕鼠比非孕鼠對(duì)鎘的毒性體現(xiàn)了更高的敏感性，表明鎘對(duì)孕鼠有明顯的生殖毒性效應(yīng)。鎘導(dǎo)致高血壓的機(jī)制包括誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、血管收縮、腎小管損傷、水鈉潴留和改變兒茶酚胺代謝等，而這些同樣是妊娠高血壓疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。本課題組進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)鎘通過(guò)多條途徑影響妊娠高血壓疾病的發(fā)展比如干擾胎盤(pán)的類固醇激素的分泌；增加胎盤(pán)DNA氧化損傷；上調(diào)B淋巴細(xì)胞中活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的表達(dá)，促進(jìn)血管緊張素II1型受體自身抗體產(chǎn)生過(guò)多，激活補(bǔ)體造成器官損傷等，引起鎘對(duì)孕鼠一系列的生殖毒性效應(yīng)及臨床病理表現(xiàn)[9-11]。

妊娠期間隨著孕齡的增長(zhǎng)鎘在胎盤(pán)逐漸聚集，孕晚期胎盤(pán)里鎘的濃度明顯大于母血及臍帶血里濃度，說(shuō)明胎盤(pán)也是鎘毒性的靶器官之一[12]。鎘在胎盤(pán)中的儲(chǔ)存本身并不是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@種金屬對(duì)胎盤(pán)功能有不利影響。鎘可能通過(guò)干擾胎盤(pán)的血流量、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、人體所必需物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝來(lái)影響胚胎的正常發(fā)育并間接影響母體的正常自我調(diào)節(jié)狀態(tài)[13]。有研究稱Wistar大鼠孕期鎘暴露導(dǎo)致胎盤(pán)鐵和鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)中斷，這可能會(huì)危及胎兒的營(yíng)養(yǎng)與活力[14]。鎘對(duì)絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞遷徙的研究結(jié)果表明，低濃度（0.5～1 μmol/L）的鎘離子雖然不影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的存活，但能通過(guò)激活半胱天冬酶而影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織，以抑制配體誘導(dǎo)的滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移[15]。此外鎘可引起活性氧和促炎性細(xì)胞因子的過(guò)量生成，都有可能導(dǎo)致妊娠高血壓疾病及胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩[16]。鎘在胎盤(pán)還可能會(huì)干擾胰島素樣生長(zhǎng)因子軸或下調(diào)β胎盤(pán)11β-羥類固醇脫氫酶2型的活性，從而抑制胎兒生長(zhǎng)[17]。鎘對(duì)胎盤(pán)的影響同時(shí)預(yù)示著其對(duì)子代發(fā)育的干擾，應(yīng)引起足夠的重視。

本研究發(fā)現(xiàn)孕鼠暴露于0.5 mg/kg鎘以后出現(xiàn)24 h尿蛋白明顯升高，表明鎘對(duì)大鼠腎臟的損傷，由病理檢查可見(jiàn)損害部位主要包括腎血管及腎小管。短時(shí)接觸鎘對(duì)腎臟的損傷是輕微的，而長(zhǎng)期接觸鎘引起的腎臟損害是不可修復(fù)的。鎘可以經(jīng)過(guò)多重途徑進(jìn)入體內(nèi)，肝臟是鎘的主要蓄積部位之一，染鎘組大鼠肝出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫變性甚至壞死、線粒體腫脹脊模糊等改變[18]。以往的研究報(bào)道鎘在腦內(nèi)的分布往往都是較低水平[19]。本研究中染鎘組大鼠出現(xiàn)腦充血，腦水腫等病理改變。可能與懷孕時(shí)母鼠血管擴(kuò)張，血腦屏障減弱有關(guān)，小劑量連續(xù)鎘暴露能夠透過(guò)血腦屏障在雌性大鼠腦內(nèi)蓄積，引起腦細(xì)胞變性等，出現(xiàn)易激惹和相互撕咬等臨床表現(xiàn)。

本研究通過(guò)注射鎘成功誘導(dǎo)妊娠高血壓疾病的大鼠模型，說(shuō)明鎘是妊娠高血壓疾病發(fā)生的重要因素之一。