瑤藥黃稔根不同極性部位對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥的保護作用△

龔 雪 韓奇亨 任 凱 張國俊 張春紅 李旻輝,2,3,4,5*

(1.包頭醫學院，內蒙古 包頭 014060；2.廣西藥用植物園廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530023；3. 內蒙古自治區中醫藥研究所，內蒙古 呼和浩特 010110；4. 內蒙古自治區特色藥用植物培育與保護工程技術研究中心，內蒙古 包頭 014060；5. 內蒙古自治區特色道地藥材資源保護與利用重點實驗室，內蒙古 包頭 014060)

黃稔根為野牡丹科酸腳桿屬植物北酸腳桿Medinilla septentrionalis(W.W.Sm.)H. L. Li的干燥全株，瑤藥名為紅節風，黃稔根生于山谷、山坡密林中或林緣陽濕處，分布于廣東、廣西、云南等地。收載于《中華本草》和《廣西壯族自治區瑤藥材質量標準》(第一卷)，黃稔根味苦、酸，性平。歸肝、大腸經，瑤藥中屬風打相兼藥。具有清熱解毒、止血涼血、消腫止痛之功效，用于小兒驚風、熱感冒、尿淋、尿血、月經不調、牙齦出血、牙周炎[1-4]。基于此，本研究以脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7而構建的炎癥細胞模型為研究對象，采用黃稔根不同極性部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位)處理炎癥模型，對黃稔根4個不同極性部位進行活性篩選，探討黃稔根不同極性部位對細胞的安全性及抗炎效果，為黃稔根的抗炎機制作用研究奠定基礎，為指導臨床安全用藥和擴大其開發利用范圍提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞，購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.1.2 藥品與試劑 黃稔根采于廣西壯族自治區上林縣大明山，經廣西藥用植物園韋坤華副研究員鑒定為野牡丹科植物北酸腳桿。藥材干燥全株經粉碎成中細粉(過四號篩)，采用乙醇提取法，以70 %乙醇加熱回流提取3次，合并提取液濃縮至干，殘渣加水溶解，分別以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，將各自萃取液濃縮至干，即得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水4個極性部位。實驗前用DMSO配成200 mg/mL的母液，再用培養基稀釋至所需質量濃度；DMEM高糖培養基(Gibco公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS，Sigma公司)；DMSO和青霉素、鏈霉素(海克隆生物化學制品(北京)有限公司)；噻唑藍(MTT，sigma公司)。

1.1.3 儀器 Thermo 311 CO2培養箱(Thermo公司)，SW-CJ超凈臺(上海新苗醫療器械制造有限公司)，XDS-1B倒置顯微鏡(上海比目儀器廠)，Thermo Scientific Multiskan FC酶標儀(Thermo公司)，臺式離心機(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7用含10 %胎牛血清，100 mg/L青霉素，100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液于37 ℃、5% CO2培養箱中培養[5]。取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2 黃稔根不同極性部位對RAW264.7細胞增殖的影響 RAW264.7細胞按1×105 個/mL接種于96孔細胞培養板中，待細胞貼壁后，分別加入系列濃度( 12.5、25、50、100、200 μg/mL) 的黃稔根不同極性部位。同時設空白對照(未加黃稔根不同極性部位)，每組設置5個平行孔，培養24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標儀測量各孔的吸光度值(OD 570 nm)，根據公式：細胞存活率 = (藥物孔OD值-本底對照孔OD值) /(對照細胞孔OD值-本底對照孔OD值)×100 %計算細胞存活率[6]。

1.2.3 黃稔根不同極性部位對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥的保護作用 取對數生長期RAW264.7細胞按1×105 個/mL接種于96孔細胞培養板中，待細胞貼壁后，分別加入不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/mL) 的黃稔根不同極性部位，保護4 h后加入終濃度為1μg/mL的LPS。設空白對照組、LPS組，LPS組+黃稔根不同極性部位組，每組設置5個平行孔，培養20 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標儀測量各孔的吸光度值( OD 570 nm)并計算細胞存活率。

2 結果

2.1 黃稔根不同極性部位對RAW264.7細胞增殖的影響 采用MTT法檢測黃稔根不同極性部位對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞增殖活性的影響。結果顯示，與空白組比較，黃稔根不同極性部位系列濃度(25、50、100、200 μg/mL)對RAW264.7細胞的增殖作用無顯著性差異(P> 0.05)。實驗結果表明，在實驗濃度范圍內黃稔根的不同極性部位對細胞增殖無影響，無細胞毒性作用(圖1)。

2.2 黃稔根不同極性部位對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥的保護作用 與LPS模型組比較，濃度為50、100、200 μg/mL黃稔根乙酸乙酯部位(圖2-b)和正丁醇部位(圖2-c)能顯著改善LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7的炎癥反應，具有較好的濃度依賴性(P< 0.05)，表明乙酸乙酯和正丁醇部位在較高濃度下具有較好的保護活性。而相同濃度的黃稔根石油醚部位(圖2-a)與LPS模型組相比僅在200 μg/mL濃度下有保護性作用，而在其它濃度下無保護性作用(P>0.05)。不同濃度的黃稔根水部位(圖2-d)并未表現出保護作用，無保護活性。

3 討論

我國是一個多民族的國家，自古以來，各少數民族在與疾病斗爭中，形成了各具特色的傳統醫藥。黃稔根雖然為瑤醫常用藥，但對其藥理研究卻甚少。為此，本實驗對黃稔根對細胞的安全性及其抗炎活性進行初步探討。結果顯示黃稔根不同極性部位對小鼠巨噬細胞RAW264.7無細胞毒性。通過LPS誘導RAW264.7構建炎癥細胞模型分析黃稔根石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位的保護性作用。研究結果發現黃稔根乙酸乙酯部位和正丁醇部位能顯著改善LPS誘導RAW264.7細胞的炎癥反應且呈現出較好的濃度依賴性。上述研究結果初步證明黃稔根對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥具有保護作用，該結果可為進一步闡明其抗炎機制奠定基礎。另外，針對黃稔根乙酸乙酯及正丁醇活性部位還需利用現代化學等技術手段進行進一步的分離和分析以確定活性單體化合物。同時，黃稔根對RAW264.7細胞炎癥是基于哪些信號通路來發揮抗炎作用的也需要更深一步的研究。