HPLC法測定藏藥小檗皮中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的含量△

次 仁 許 芳 高 萬 吉騰飛*

(1. 西藏藏醫學院,西藏 拉薩 850000；2. 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京協和醫學院&中國醫學科學院藥物研究所，北京 100050)

藏藥小檗皮為小檗科植物小檗(Berberis kansuensis Schneid.)莖或根的內皮，具有清熱解毒、燥濕之功，用于治療痢疾、尿路感染、腎炎及瘡癤、結膜炎等疾病。作為藏醫常用藥材，藏成藥小檗眼膏、八味小檗皮丸、四味姜黃湯散中均含有此藥。小檗屬植物中含有季胺型生物堿小檗堿(berberine)、巴馬汀(palmatine)，文獻報道的分析方法主要有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細管電泳法(CE)等[1-9]。在現行版藏藥標準中，僅對該藥材的性狀、鑒別等生藥特性進行描述，暫無化學成分的測定。查閱文獻資料，目前僅測定小檗皮中小檗堿的含量[10]，而巴馬汀的含量測定未見報道。為此，課題組擬建立HPLC法測定藏藥小檗皮中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的含量，為健全藏藥質量標準、有效控制藏藥質量提供參考依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國惠普公司，DAD檢測器)，電子天平(日本AND公司，HA-202M)。

鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110713-200609)；鹽酸巴馬汀對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：0732-200005)；小檗皮經西藏藏醫學院次仁博士提供并鑒定為小檗科植物甘肅小檗的干燥莖皮。乙腈為色譜純(Merck公司)，甲醇為色譜純(Merck公司)，水為去離子水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗 色譜柱為 Aglient XDB C18(4.6mm×50mm，5μm)，流動相為水-乙腈-乙酸-三乙胺(70:30:0.5:0.745)等度洗脫，體積流量1.0mL/min，檢測波長345nm，柱溫：30℃，進樣量10μL。

數據處理：峰面積外標法定量。在此色譜條件下，對照品鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀峰形對稱，小檗皮供試品的色譜中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀能與其它成分很好分離。

2.2 對照品儲備液的配制 精密稱取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀各2.000mg，分別置10mL 量瓶中，加甲醇溶解定容至10mL，制成0.2mg/mL的對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備 稱取小檗皮樣品粉末0.1g左右，精密稱定，加1%鹽酸甲醇100mL，超聲提取30min，蒸干，加甲醇溶解，轉移至25mL容量瓶中，定容，用0.45μm濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.4 線性關系考察 精密吸取 2.2 項下對照品儲備液，制成濃度為40.0、80.0、120.0、160.0、200.0μg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液和濃度為1.60、3.20、4.80、6.40、8.00μg/mL的鹽酸巴馬汀對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液10μL，按上述色譜條件，依次注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為橫坐標對鹽酸小檗堿對照品(μg) 繪制標準曲線，得回歸方程為：Y = 920.88X-25.221，r2=0.9999，線性范圍為0.400～2.000μg。以峰面積為橫坐標對鹽酸巴馬汀對照品(μg) 繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=31.445X-4.665，r2=0.9999，線性范圍為0.016～0.800μg，結果見表1、表2。

表1 鹽酸小檗堿的線性關系

表2 鹽酸巴馬汀的線性關系

2.5 精密度考察 精密吸取對照品溶液 10μL，重復進樣5次，測定峰面積。測得鹽酸小檗堿的RSD為0.19%，鹽酸巴馬汀的RSD為0.082%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性考察 取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，16h進樣測定，鹽酸小檗堿的RSD為0.69%，鹽酸巴馬汀的RSD為0.82%。表明該供試品溶液在16h內穩定性良好。

2.7 重復性考察 精密稱取同一樣品粉末6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，鹽酸小檗堿的RSD為0.07%；鹽酸巴馬汀的RSD為0.003%。

2.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀含量的小檗皮樣品粉末0.05g，共5 份，加入對照品適量，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，計算回收率。鹽酸小檗堿的加樣回收率98.5%，RSD=1.49%；鹽酸巴馬汀的加樣回收率為97.5%，RSD=1.23%，結果見表3、表4。

表3 鹽酸小檗堿的加樣回收率試驗結果

表4 鹽酸巴馬汀的加樣回收率試驗結果

3 含量測定

精密吸取供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，2.1項下色譜條件測定，計算鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的含量。結果見表5。

表5 鹽酸巴馬汀的加樣回收率試驗結果

4 討論

4.1 提取條件的選擇 分別采用甲醇、乙醇、50%乙醇、50%甲醇和1%鹽酸甲醇等不同溶劑超聲，比較超聲提取及加熱回流提取的效果，1%鹽酸甲醇超聲提取結果最好，故選擇其為提取溶劑。

對不同提取時間進行了考察，以1%鹽酸甲醇為提取溶劑分別超聲提取 10、20、30、45、60 min，結果發現 30 min 與 45 min 的提取效果基本一致，故選擇超聲提取 30 min。

4.2 色譜條件的選擇 由于檢測僅2種化學成分，且2者均為檢驗，本實驗選用等度洗脫。因2種成分的最大吸收波長均為345 nm，故以345 nm 為測定波長。

4.3 流動相的選擇 選擇甲醇-水系統時，分離不好；選擇甲醇- 0.1 % 磷酸系統的分離效果好，且與樣品其他成分分離較好，能夠滿足實驗要求。

5 結論

本研究采用HPLC法建立了藏藥小檗皮中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的測定分析方法。該藥材中鹽酸小檗堿的含量約為鹽酸巴馬汀的20倍，可明確鹽酸小檗堿是其活性成分之一。同時，該方法可以同時測定小檗皮中2種不同化學成分，方法簡便、準確，重復性好，可為藏藥小檗皮藥材的質量標準制定提供依據。