乳鼠雪旺細胞與自體顱骨組織塊體外聯合培養對顱骨組織生長的影響

李鐘鵬 龐芳河 (廣西醫科大學附屬口腔醫院綜合門診，廣西 南寧 530021)

骨組織工程學發展迅速，在諸多領域取得良好成果，隨著支架材料研究的深入，大量復合支架材料在骨缺損修復中被廣泛研究〔1〕，但因神經化、血管化因素的影響使復合支架材料在臨床上沒有被廣泛應用。組織工程化骨組織在體內存活的關鍵因素為完善的神經支配和充足的血液供應，近年來組織工程化骨的血液供應方面的研究取得比較大的進步〔2，3〕，但神經支配仍然是組織工程化骨面臨的難題。雪旺細胞為周圍神經膠質細胞，為常用的周圍神經組織工程種子細胞〔4，5〕。本文將雪旺細胞與自體顱骨組織聯合培養觀察其對顱骨生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗乳鼠:出生1～5 d、清潔級、雄性、Sprague Dawley乳鼠(購自廣西醫科大學動物中心，許可證號為SCXK桂2014-0001)。實驗試劑:BFGF和鈦板(武漢德骼拜爾外科植入物有限公司)，S-100抗體、SABC試劑盒等(武漢博士德生物工程公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶、DMEM培養基、胎牛血清等(美國Gibco公司)。

1.2 雪旺細胞培養和純化及鑒定 取乳鼠9只頸椎脫臼處死，浸泡乙醇中消毒，將消毒后乳鼠治愈解剖板上分離坐骨神經，將其剪成約1 mm3組織碎塊，加入胰蛋白酶和膠原酶，移入離心管中，在水浴振蕩箱中消化 35 min，加入 DMEM培養基終止消化，離心(1 000 r/min)5 min，棄去上清液，重懸離心后細胞。取細胞懸液加入RP管中，加入臺盼藍混勻，取混合液滴加到細胞計數板上，計數未被染液著色的細胞數目，將細胞(密度為1×105個/ml)接種到培養皿，12 h換液并加入阿糖胞苷，48 h換液，觀察細胞生長情況。將上述細胞培養12 d，胰蛋白酶進行消化，然后接種到6孔板中培養3 d，采用S-100抗體鑒定:磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞爬片，多聚甲醛固定，PBS清洗，加入過氧化氫(H2O2)阻斷血源性過氧化物酶，PBS清洗，加入胎牛血清(BSA)封閉血清，PBS清洗，加入兔S-100單克隆抗體孵育，PBS清洗，加入生物素化羊抗小鼠孵育，PBS清洗，加入SABC孵育，PBS清洗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，顯微鏡下觀察出現陽性染色、背景不著色為準，晾干玻片，中性樹膠封片。

1.3 顱骨組織塊取材、分組及處理 取9只乳鼠斷頸處死，乙醇中消毒，PBS沖洗，無菌條件下取出顱骨，剔除骨外膜、內膜等纖維結締組織，PBS沖洗露骨組織，剪成2 mm×2 mm大小顱骨塊，每只乳鼠取3塊，共27塊顱骨塊。將27塊顱骨組織塊分為A組、B組和C組，每組9塊，分別培養1 w、2 w、3 w。A組顱骨組織塊單獨培養，不加雪旺細胞干預;B組為雪旺細胞和顱骨組織快直接接觸培養，將濃度為1×106個/ml的雪旺細胞懸液加入DMEM培養皿中，將顱骨組織塊加入培養皿中和雪旺細胞直接接觸培養;C組為雪旺細胞和顱骨組織塊通過鈦板間接接觸培養，將濃度為1×106個/ml的雪旺細胞懸液加入DMEM培養皿中貼壁生長，放入鈦板，將顱骨組織快放入鈦板上的空隙內，使雪旺細胞和顱骨組織塊間接接觸培養。

1.4 顱骨組織BGP和OPN水平測定 三組分別在培養1 w、2 w、3 w時取材，每周取3塊顱骨組織塊，甲醛固定、石蠟包埋，采用常規HE染色，采用免疫組化法測定顱骨組織BGP和OPN水平，采用Image-ProP-lus6.0圖像處理系統對圖片進行分析，測定骨組織中陽性細胞及基質中染色光密度值。每周3個顱骨組織塊，每塊取4個切片，每組切片取3個視野，共36個視野，陽性表達的灰度值為該顱骨塊的平均光密度值。

1.5 培養液中BALP活性含量測定 收集培養1 w、2 w、3 w時三組培養液，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定培養液中BALP活性含量，具體步驟按照說明書進行。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行方差分析及S-N-K檢驗。

2 結果

2.1 雪旺細胞培養和純化及鑒定 接種24 h后大部分雪旺細胞已貼壁生長;接種48 h后細胞呈梭形，細胞兩端突起不等;接種7 d大部分雪旺細胞胞體平行排列，細胞呈極性生長;接種12 d雪旺細胞交織成網狀，大部分連接在一起呈“地毯”狀。見圖1。對接種14 d雪旺細胞進行免疫組化染色，發現雪旺細胞邊界清楚，胞體呈梭形，胞質黃染;雪旺細胞純度在89%左右。見圖2。

2.2 三組顱骨組織中BGP水平比較 三組之間BGP水平差異有統計學意義(F=18.912，P＜0.001)。兩兩比較:B組各時間點BGP水平明顯高于A組和C組(P＜0.05)，C組各時間點BGP水平明顯高于A組(P＜0.05);同組不同時間點BGP水平比較差異有統計學意義(P＜0.05)，隨著時間延長BGP水平升高。見表1和圖3。

圖1 雪旺細胞培養結果(HE，×400)

圖2 雪旺細胞免疫組化染色(DAB，×400)

表1 三組顱骨組織培養不同時間BGP水平比較(，n=36，%)

表1 三組顱骨組織培養不同時間BGP水平比較(，n=36，%)

與B組比較:1)P＜0.05;與A組比較:2)P＜0.05;與同組前一時點比較:3)P＜0.05，下表同

組別 第1周 第2周 第3周A 組 7.487±2.4961) 8.358±1.8121)3) 11.953±1.1321)3)B 組 11.895±3.602 13.703±3.4853) 18.381±5.214 C 組 9.485±3.5481)2) 10.760±2.1531)2)3) 15.925±3.2141)2)3)

圖3 各組培養不同時間BGP免疫組化染色(DAB，×400)

2.3 三組顱骨組織中OPN水平比較 三組之間BGP水平差異無統計學意義(F=1.510，P＞0.05)。不同時間點和不同組間兩兩比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表2和圖4。

2.4 三組顱骨組織BALP活性比較 三組之間BALP活性含量差異有統計學意義(F=8.726，P＜0.05)。兩兩比較:B組各時間點BALP活性含量明顯高于A組和C組(P＜0.05)，C組各時間點BALP活性含量明顯高于A組(P＜0.05);同組不同時間點BALP活性含量比較差異有統計學意義(P＜0.05)，隨著時間延長BALP活性含量升高。見表3。

表2 三組培養不同時間顱骨組織中OPN水平比較(，n=36，%)

表2 三組培養不同時間顱骨組織中OPN水平比較(，n=36，%)

組別 第1周 第2周 第3周A 組 9.669±1.304 10.124±2.138 9.203±1.063 B 組 10.786±2.115 10.197±1.212 11.034±2.142 C 組 9.272±1.008 10.710±1.058 9.135±2.285

圖4 各組培養不同時間OPN免疫組化染色(DAB，×400)

表3 三組培養不同時間顱骨組織中BALP活性比較(，n=9，金氏單位/L)

表3 三組培養不同時間顱骨組織中BALP活性比較(，n=9，金氏單位/L)

組別 第1周 第2周 第3周A 組 97.434±12.2041) 102.588±24.5211)3)137.581±18.1591)3)B 組 123.203±19.634 302.789±60.4153) 709.713±48.9853)C 組 100.011±22.0451)2)214.658±21.2081)2)3)370.074±37.7561)2)3)

3 討論

隨著組織工程骨研究的深入，如何使構建的組織工程骨在體內存活并迅速發揮作用是目前面臨的主要問題，骨組織為一種復合體，不是單一的硬性組織，還含有血管、神經、筋膜等其他軟組織，帶有血管系統和神經支配的復合組織工程骨的構建是比較理想的解決方案，在構建組織工程骨的同時重建神經支配和血液供應是組織工程骨從基礎研究到臨床的關鍵問題〔6～8〕。目前血管化組織工程骨的研究取得了較大進展〔9～11〕，而神經化組織工程骨仍是目前面臨的問題。神經和營養血管進入骨髓，對骨組織的形成、發育及代謝發揮重要作用;周圍神經及其分泌的神經肽對骨的再生具有重要作用，雪旺細胞的存在形式有兩種，一種包繞軸突形成髓鞘，一種包繞軸突不形成髓鞘，雪旺細胞的成熟過程包括:雪旺細胞前體-不成熟雪旺細胞-成熟雪旺細胞，主要來源于神經嵴細胞，可分泌神經營養因子、神經生長因子及血小板生長因子、轉移生長因子等其他細胞因子，神經營養因子具有神經再生提高支架和再生環境、清除細胞碎片、組織神經元細胞凋亡等作用;神經生長因子參與神經細胞的生長、再生和發育等;血小板生長因子等其他細胞因子可促進神經元細胞增殖分化、細胞外基質合成等〔12〕。雪旺細胞在神經細胞再生中具有重要作用，是周圍神經組織工程常用的種子細胞〔13〕。BGP是重要的骨代謝指標，BGP水平高低和影響骨改建過程，成骨細胞功能增強則BGP水平升高，成骨細胞功能減弱則 BGP水平下降〔14，15〕。本研究表明雪旺細胞可促進成骨細胞功能，其中兩者直接接觸發揮主要促進作用。OPN有骨細胞、破骨細胞、成骨細胞分泌，為分泌性磷酸化蛋白，可識別骨基質和破骨細胞之間黏附，并通過對骨基質和破骨細胞之間黏附的調節影響骨吸收〔16，17〕，本研究發現雪旺細胞和顱骨組織共同培養對骨組織OPN水平的影響不明顯，考慮雪旺細胞對顱骨組織的改建和吸收影響不大。BALP由成骨細胞生產，在骨形成和骨細胞活性中發揮重要作用，骨形成超過骨吸收時，成骨細胞分泌大量的BALP，引起BALP活性增加〔18〕，本研究發現雪旺細胞可增加骨組織BALP活性，促進骨組織生長，其中兩者直接接觸發揮主要促進作用。