RhoA/Rho激酶信號通路在肺動脈高壓中作用及尼索地平對其影響

杜梅素 岳春景 杜景霞 (邢臺醫學高等?？茖W?；A醫學部，河北 邢臺 054000)

肺動脈高壓(PH)是一種以肺血管阻力持續升高及內膜重構、增生為主要表現的一組疾病總稱，是心血管領域常見的臨床綜合征，具有較高的發病率及死亡率〔1〕，主要位于血管中膜的肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)易受到異常因素的刺激而轉化成合成型，并且從血管中膜轉移至內膜進行異常增殖〔2〕。5-羥色胺(HT)主要分布在血小板致密體內，可以通過結合PASMCs上受體激活相應的信號轉導機制來影響PASMCs增殖及凋亡，從而引起肺血管收縮〔3〕。Rho激酶(ROCK)能夠對細胞增殖及周期變化進行調節，ROCK信號通路介導的各細胞功能在PH發生發展中起重要作用。該信號通路的激活主要與胞質內Ca2+濃度、鈣調蛋白有關〔4〕，在目前應用廣泛的抗 PH藥物中，鈣拮抗劑屬于較為常用的藥物之一，尼索地平(Nis)為二氫吡啶類鈣拮抗劑，因此推測Nis是ROCK通路激活的重要抑制物質。本文觀察ROCK信號通路在5-HT誘導的PASMCs增殖中變化及Nis對此變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Wistar大鼠20只，體重200 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗試劑 5-HT(Sigma公司，美國)，DEMF/F12培養基、胎牛血清(Gibco公司，美國)，胰蛋白酶(Amersco公司，美國)，MTT(Serva公司，德國)，磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亞基(MYPT)1、p-MYPT1抗體(Upstate公司，美國)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(PIERCE 公司，美國)，RhoA、ROCK、β-action(捷瑞生物工程公司，中國)

1.3 PASMCs培養及鑒定〔5〕烏拉坦(20%，5 ml/kg)麻醉大鼠后將其斷頸處死后迅速開胸處理，取出其肺組織后即刻在無菌條件下(超凈工作臺內)輕柔分離其肺動脈主干及肺動脈，解剖顯微鏡下用棉簽將肺動脈周圍組織剪去后剝除纖維外膜及內膜，用角膜剪將分離出的肺動脈中膜反復剪碎剪成約0.5 mm×1.0 mm的小塊，將其平鋪于培養瓶瓶底，待其均勻分布后進行原代培養，用含有20%胎牛血清的 DMFM-F12培養液在適宜環境下(37℃，5%CO2、21%O2、濕度 95%的培養箱內)靜置培養約24 h。當原代培養的細胞形成細胞暈后將上懸液及組織碎塊去除，在沉淀的細胞內加入胰蛋白酶消化法將原代培養細胞進行消化分離后傳代培養。在同一視野內利用倒置顯微鏡觀察分析相應的細胞形態，SP法進行α-actin免疫組化染色對培養的細胞進行鑒定，并且選取第3～6代生長狀態良好的PASMCs進行后續實驗。

1.4 MTT法檢測PASMCs增殖 將已配制的細胞懸液濃度調節為每升2×107個細胞，96孔板中每孔接種200 μl并培養24 h，細胞周期同步化處理后將其隨機分為對照組(1%胎牛血清培養基處理)、5-HT組(1%胎牛血清培養基中加入1 μmol/L的5-HT)及實驗組(1、2、3、4 組)即 Nis 1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10－8mol/L 組，以上各組均設置 6 個平行孔。各實驗組進行預處理，即先加入不同濃度的Nis，20 min 后加入 5-HT(1 μmol/L)，等待 1 d 從而使PASMCs能夠單層鋪滿孔底。完成后，每孔均加入MTT 液(5 g/L)20 μl，37℃孵育 4 h 后結束整個培養過程。吸出培養液，通過添加200 μl二甲基亞砜，并在室溫環境下震蕩10 min，從而能夠溶解所有結晶，其中，假設波長為490 nm時測定吸光度值。

1.5 RT-PCR測定RhoA及ROCK mRNA的表達 將同步化處理后的細胞隨機分組，分組方法同1.4，20 min后加入 5-HT(1 μmol/L)處理 30 min。完成后進行消化分離各組細胞，從NCBI基因數據庫中下載大鼠 RhoA、ROCK及 β-actin基因 cDNA的序列，其RhoA、ROCK及β-actin的上下游PCR擴增引物采用Primer Premier5軟件進行處理，同參考文獻〔2〕。對已進行消化分離的各組細胞進行總RNA的分離提取，對1 μg量的總RNA進行逆轉錄，逆轉錄后取1 μg逆轉錄產物cDNA進行免疫熒光測定。其中，擴增條件為:95℃預變性4 min，94℃變性及53℃退火各40 s，72℃延伸90 s及10 min，共35個循環，重復3次。在進行目的基因的測定過程中測定產物的灰度值，并且各組擴增產物mRNA的表達量根據目標產物與β-actin的變化倍數確定。

1.6 Western印跡檢測蛋白定量及MYPT1磷酸化水平 將同步化處理后的細胞隨機分為5-HT(1 μmol/L)處理 0、5、15、30、60、120 和 180 min 組，以確定5-HT作用最敏感的時間點。將同步化處理后的細胞隨機分組，分組方法同1.4，20 min后加入5-HT(1 μmol/L)處理15 min。處理結束后小心將培養液棄去，并且將100 μmol細胞裂解液RIPA加至各個培養皿中，1 μl的蛋白酶抑制劑，經超聲處理2 min后置于冰上裂解60 min，通過在4℃下進行1 200 r/min離心20 min，將各組細胞的漿蛋白提取后運用BCA法(依據BCA試劑盒說明書)進行蛋白定量，運用裂解液將蛋白濃度規劃至同一水平后，依次加入反應引物進行電泳、轉膜和封閉，根據已測定的蛋白加樣量將60 μg等量蛋白電泳凝膠分離，結束后將膠板取出并分離，后再經電轉(300 mA，70 min)至4℃的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2 h，完成轉膜后將 PVDF膜漂洗1 min，含5%脫脂奶粉的等滲緩沖鹽溶液TBST在密閉的室溫環境下靜置1 h后注入一抗，并在環境溫度4℃下靜置一夜，在第二天通過洗膜液磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗10 min，重復3次，加入二抗后置于搖床上，在室溫下靜置1 h后，再次進行重復洗膜，每次10 min，重復3次，結束后掃描PVDF膜成像。運用相關軟件(ChemiDoc XRS成像系統)對其蛋白進行測定，其結果以所檢測蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值來表示。MYPT1磷酸化水平通過 p-MYPT1與MYPT1的比值表示。

1.7 統計學方法 利用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 Nis對5-HT誘導的大鼠PASMCs增殖的作用大鼠PASMCs形狀呈長梭形，平行束狀排列，呈波谷狀生長。1 μmol/L的5-HT能促進PASMCs增殖，而不同濃度的Nis均能夠抑制該種增殖，并且其抑制作用與Nis濃度相關，呈現出一定的濃度依賴性。

2.2 Nis對大鼠 PASMCs在5-HT作用下 RhoA及ROCK mRNA表達的影響 不同濃度Nis預處理均能降低5-HT誘導的PASMCs內RhoA及ROCK mRNA升高，并且這種濃度差異和降低程度有一定關系，差異有統計學意義(P＜0.05)。1×10-8mol/L的 Nis對ROCK mRNA表達仍有一定的降低作用，且差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組RhoA及ROCK mRNA表達(，n=6)

表1 各組RhoA及ROCK mRNA表達(，n=6)

與對照組相比:1)P＜0.05，與5-HT組相比:2)P＜0.05;表2同

組別 RhoA/β-actin ROCK/β-actin對照組 1.316±0.046 2.502±0.043 5-HT 組 4.261±0.0271) 5.363±0.7201)實驗1組 1.532±0.1122) 2.693±0.0362)實驗2組 1.693±0.0962) 2.742±0.0672)實驗3組 2.874±0.1062) 3.003±0.1072)實驗4組 3.102±0.1362) 4.078±0.0572)

2.3 Nis對大鼠PASMCs在5-HT作用下MYPT1磷酸化水平的影響 5-HT作用下大鼠PASMCs中胞質染色均呈陽性表現，且作用15 min時，胞質染色陽性表現最強。Nis作用后，與5-HT作用15 min組相比PASMCs中胞質染色深度下降，呈弱陽性。PASMCs中p-MYPT1在5-HT組呈現出明顯的增殖特征(P＜0.05)。不同濃度Nis的預處理不同程度地降低了5-HT誘導的PASMCs內p-MYPT1表達，且差異有統計學意義(P＜0.05)，見表 2。

表2 各組MYPT1及磷酸化水平(，n=6)

表2 各組MYPT1及磷酸化水平(，n=6)

組別 MYPT1/β-actin p-MYPT1/MYPT1對照組 1.215±0.503 1.362±0.201 5-HT 組 2.173±0.3231) 3.063±0.0301)實驗1組 1.331±0.7622) 1.492±0.0152)實驗2組 1.466±0.2632) 1.573±0.0272)實驗3組 1.637±0.3522) 1.732±0.0102)實驗4組 1.833±0.4322) 2.335±0.0012)

3 討論

PH是在各種因素作用下以血管平滑肌細胞增殖、肥大從而引起血管重塑及肺血管阻力進行性升高為主要病理改變的一種原發或繼發性疾病〔6〕。平滑肌細胞增殖等改變能夠引起血管內徑及管壁厚度隨之發生與病理環境相適應的改變〔7〕，若這種改建超出機體生理性的承受范圍，則會存在一定的危險性。因此，在一定程度上對PASMCs增殖改變進行抑制可以對肺血管重構起到改善的作用。

5-HT是生物體內的一種生物胺，能夠通過相應受體誘發細胞內信號轉導機制〔8〕，在它的介入下，酪氨酸激酶的活性得到提升，導致酪氨酸形成磷酸類化合物，最終加快了細胞有絲分裂的速度，從而調節PASMCs增殖與凋亡。在平滑肌細胞和肺血管內膜中有一種可以運載5-HT的膜蛋白，即5-HT轉運體(5-HTT)。5-HT通過5-HTT主動轉運使其進入細胞內，與相應受體結合后，使細胞內環境中Ca2+濃度明顯升高，使其細胞增殖的相關信號被開啟，這可能是其誘導形成PH的主要機制之一。本研究表明5-HT對PASMCs增殖有明顯促進作用，也證實了以上觀點。

RhoA主要通過與下游的效應分子Rho激酶相結合而發揮重要的作用〔9〕，對于廣泛存在于體內各個組織細胞的RhoA/Rho激酶來說，由于其具有調節細胞增殖的功能，因此該信號通路被過度激活時能夠誘發PASMCs發生有絲分裂或協同有絲分裂，平滑肌細胞增殖，從而導致肺血管的重構，同時肺血管阻力呈進行性增加。以往研究表明，RhoA蛋白活性增強的過程中，細胞內的鈣調蛋白及Ca2+的濃度發揮了重要的作用，而 Ca2+充分扮演了第二信使的作用，能誘發PASMCs的興奮-收縮耦聯機制及興奮-轉錄機制來調節肺血管的收縮及增加細胞因子的表達來促進肺血管重塑〔10，11〕。本實驗中，5-HT 對于大鼠 PASMCs 內ROCK和RohA mRNA的表達具有增強作用，但Nis對這一現象有明顯的抑制作用，并且該抑制作用與Nis自身濃度呈現出一定的相關性，與以往研究相符〔2〕。在RhoA的下游，ROCK不僅能夠發揮靶效應，而且由于其活性得到激發，還能促使其下游的MYPT1產生磷酸性化合物，使其失去活性，并最終使得細胞的增殖、衰敗、遷移及黏附等生物學行為和功能受到破壞〔12〕。因而，大鼠PASMCs內MYPT1磷酸化與ROCK活化程度有較大相關性。隨著作用時間的增加，大鼠PASMCs內MYPT1磷酸化水平逐漸增加，這充分表明了在5-HT誘導PASMCs異常增殖的過程中，RhoA/Rho激酶信號通路發揮了重要作用，并且不同濃度的Nis均明顯能夠降低MYPT1的磷酸化程度，對ROCK活化起到了抑制作用，且在最低濃度的作用下其磷酸化水平仍有所下降，進一步證明了 Nis能夠抑制RhoA/ROCK(RhoA/Rho激酶)信號通路的作用。

綜上，5-HT作用下PH大鼠PASMCs存在增殖及RhoA/Rho激酶信號通路的異常表現，Nis能夠抑制該細胞的異常增殖并調節信號通路的表達，防止肺血管重構。