玉米紫色植株色素對氟化鈉誘導成骨細胞氧化損傷的保護作用

張 卓 周 波 郭連瑩 王曉紅 于 葉 (沈陽醫學院營養與食品衛生學教研室，遼寧 沈陽 110034)

氟骨癥是由于長期攝入過量的氟化物引起氟中毒并累及骨組織的一種慢性侵襲性全身性骨病，是氟中毒的典型癥狀。氟骨癥多發于青壯年，但以老年患者發病率高、病情嚴重〔1〕。研究顯示〔2〕，氟可通過誘導骨組織氧化失衡，進而導致骨代謝紊亂，最終引發氟骨癥。其中，氟誘導的氧化應激抑制成骨細胞增殖已成為氟骨癥發生發展的重要原因之一〔2，3〕。學者在體內外實驗中觀察到，外源性抗氧化劑在氟骨癥的防治過程中起積極作用〔4，5〕。玉米紫色植株色素(MPPP)屬于天然花色苷類色素，以矢車菊素-3-葡萄糖苷(45.96%) 和 3 ＇，4 ＇-二 羥 基 花 色 素-3-葡 萄 糖 苷(12.99%)含量最為豐富〔6〕。前期實驗已證實，MPPP在體內外均具有較強的抗氧化活性〔7～9〕，且 MPPP可增強染氟成骨細胞的增殖能力〔10，11〕，但機制不詳。本研究以MC3T3-E1成骨細胞為體外干預模型，分別觀察MPPP對過氧化氫(H2O2)和氟化鈉(NaF)所致成骨細胞氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 MPPP(遼寧省東亞種業有限公司);NaF(Sigma公司);H2O2(Sigma公司);改良型α-MEM培養基(賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司);胎牛血清(FBS，天津灝洋生物制品科技有限公司);MTT試劑(Sigma公司);總抗氧化能力(T-AOC)測試盒(碧云天生物技術公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術公司)。BB-15型CO2培養箱(美國Heraeus公司);Sonics超聲波破碎儀(美國SM公司);H-7650透射電鏡(日本日立公司);SPECTRA MAX PLUS 384全光譜掃描儀(美國MD公司)。

1.2 細胞培養 MC3T3-E1成骨細胞購于中科院上海生命科學研究所。復蘇后，置于改良型α-MEM培養液(10%FBS)中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，常規換液傳代。

1.3 主要溶液配制 取MPPP 0.5 g、NaF 0.042 g及H2O20.1 ml分別溶解于10 ml培養液(2%FBS)，0.22 μm膜過濾除菌，濃度均為10－1mol/L。再根據前期實驗結果〔10，11〕，用相同培養液等倍稀釋至終濃度:MPPP 為 10－7、10－6及 10－5mol/L;NaF 為 10－3mol/L;H2O2為5×10－4mol/L。上述溶液均現用現配。

1.4 MTT法檢測細胞增殖 細胞消化后，調整密度5×104個，并接種于96孔板(每孔150 μl)。48 h后，換培養液150 μl(2%FBS)，同步化24 h后，吸棄培養液，并分別進行下列實驗，①H2O2對MPPP預處理成骨細胞的影響:共設5組，每組8個復孔，陰性和陽性對照組均換 150 μl培養液(2%FBS)，低、中、高濃度色素組均更換色素濃度為 10－7、10－6及 10－5mol/L 的培養液 150 μl(2%FBS)，繼續培養 24、48、72 h。于結束時間前5 h，吸棄各孔中培養液，陰性對照孔更換培養液(2%FBS)，其余各孔更換含 H2O2濃度為5×10－4mol/L的培養液(2%FBS)，1 h后磷酸鹽酸緩沖液(PBS)清洗，向各孔中加入 MTT溶液 20 μl(5 mg/ml)，4 h后吸棄空中培養液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，37℃ 混勻 10 min 后，酶標儀490 nm檢測OD值;②MPPP對染氟成骨細胞的影響:共設5組，每組8個復孔，分別添加下列培養液150 μl(2%FBS):陰性對照組、陽性對照組(NaF:10－3mol/L)、低濃度色素組(NaF 10－3mol/L+MPPP 10－7mol/L)、中濃度色素組(NaF 10－3mol/L+MPPP 10－6mol/L)和高濃度色素組(NaF 10－3mol/L+MPPP 10－5mol/L)，繼續培養24、48 h和72 h，實驗結束前4 h向各孔加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，繼續培養4 h，吸棄孔中培養液，PBS 小心清洗后，每孔加入 DMSO 150 μl，37℃混勻10 min，酶標儀490 nm處檢測OD值。

1.5 T-AOC檢測 細胞消化后，調整密度2×104個，接種于24孔板，每孔1 ml，繼續培養72 h。吸棄孔中培養液，2%FBS培養液同步化24 h后，將細胞分為5組，每組4個復孔，分別按照1.4中①和②的操作過程添加受試物，并置于培養箱分別培養72、48 h后，細胞消化，PBS清洗，轉移至1.5 ml離心管中，4℃超聲破碎，低溫高速離心5 min，取上清液，按試劑盒說明書進行操作，分別測定各組樣品中蛋白含量和T-AOC。

1.6 透射電鏡標本制備 調整細胞密度2×104個，接種于24孔板，每孔1 ml，繼續培養72 h。吸棄孔中培養液，2%FBS培養液同步化24 h后，將細胞分為5組，按照1.4中②的操作過程添加受試物，并置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養48 h后，胰酶消化，PBS清洗離心后收集細胞，2.5%戊二醛固定24 h，沖洗，1%四氧化鋨固定，梯度乙醇逐級脫水，環氧樹脂定向包埋后做超薄切片，經醋酸鈾及檸檬酸鉛雙重染色后，在HITACHI H-7650透射電鏡下觀察并拍照。

1.7 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析、LSD檢驗。

2 結果

2.1 H2O2對MPPP預處理成骨細胞增殖的影響 陽性對照組各OD值顯著低于陰性對照組(P＜0.01或P＜0.05);MPPP預處理24和48 h后，低、中、高濃度色素組OD值與陽性對照組比較均無明顯變化(P＞0.05);而MPPP預處理72 h后，低、高濃度色素組OD值顯著高于陽性對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 H2O2對MPPP預處理的成骨細胞增殖的影響(，n=8)

表1 H2O2對MPPP預處理的成骨細胞增殖的影響(，n=8)

與陰性對照組相同培養時間比較:1)P＜0．05，2)P＜0．01;與陽性對照組相同培養時間比較:3)P＜0．05

組別 24 h 48 h 72 h陰性對照組 0．130±0．016 0．146±0．016 0．165±0．010陽性對照組 0．109±0．0072) 0．131±0．0111) 0．141±0．0111)低濃度色素組 0．109±0．0232) 0．137±0．014 0．159±0．0173)中濃度色素組 0．109±0．0112) 0．136±0．013 0．148±0．026高濃度色素組 0．100±0．0132) 0．135±0．013 0．158±0．0253)

2.2 MPPP對NaF處理成骨細胞增殖的影響 陽性對照組和低、中、高濃度色素組OD值均顯著低于陰性對照組(P＜0.01);48 h高濃度色素組顯著高于陽性對照組(P＜0.01)，見表 2。

2.3 MPPP對H2O2和NaF處理成骨細胞T-AOC的影響 與陰性對照組(100.00%±5.84%)比較，H2O2可顯著降低陽性對照組(31.21%±4.85%)和低、中、高濃度色素組(36.01%±8.16%、36.42%±15.87%、60.78%±10.70%)成骨細胞 T-AOC(P＜0.01)，但高濃度色素組成骨細胞T-AOC明顯高于陽性對照組(P＜0.01);此外，與陰性對照組(100.00%±8.69%)比較，NaF可顯著降低陽性對照組(44.11%±8.69%)和低濃度色素組(49.57%±12.47%)成骨細胞T-AOC(P＜0.01)，但中、高濃度色素組(68.09%±9.29%、88.56%±10.45%)成骨細胞T-AOC明顯高于陽性對照組(P＜0.01)。

2.4 MPPP對染氟成骨細胞超微結構的影響 電鏡下觀察，陰性對照組的成骨細胞，細胞核形狀完整、核膜界限清晰、核內染色質均勻分布，胞質內細胞器較多，可見豐富的粗面內質網、線粒體和糖原顆粒;陽性對照組的成骨細胞胞質成分減少，輕度核固縮，染色質濃縮邊集，細胞內廣泛線粒體明顯腫脹，嵴斷裂或消失，內質網擴張，部分線粒體腫脹空泡化;而色素干預條件下的成骨細胞細胞器增多，線粒體腫脹程度減弱，細胞核輪廓清晰，細胞的病理學改變減輕。見圖1。

表2 MPPP對NaF處理的成骨細胞增殖的影響(，n=8)

表2 MPPP對NaF處理的成骨細胞增殖的影響(，n=8)

與陰性對照組比較:1)P＜0．01;與陽性對照組比較:2)P＜0．01

組別 24 h 48 h 72 h陰性對照組 0．188±0．020 0．231±0．006 0．262±0．030陽性對照組 0．155±0．0131) 0．181±0．0131) 0．141±0．0211)低濃度色素組 0．158±0．0081) 0．178±0．0191) 0．160±0．0161)中濃度色素組 0．157±0．0121) 0．189±0．0201) 0．144±0．0201)高濃度色素組 0．159±0．0111)0．197±0．0101)2)0．155±0．0151)

圖1 MPPP對染氟成骨細胞超微結構的影響(×10 000)

3 討論

在正常的骨代謝過程中，由成骨細胞和破骨細胞分別參與的骨形成和骨吸收始終保持著動態平衡，骨組織處于穩定狀態。此平衡一旦被打破，骨形成和(或)骨吸收作用相對增強或減弱，即可發生骨量異常，引發相應的骨代謝疾病〔12〕。特別是在氟中毒狀態下，成骨細胞和破骨細胞均可呈現不同程度的活躍狀態〔2，3〕，打破了骨形成和骨吸收作用之間的平衡，最終導致氟骨癥。研究顯示，成骨細胞對氟極其敏感，在高劑量氟作用下，其活性受到明顯抑制，成骨作用減弱〔13〕，骨重建失衡，表現為骨質疏松或軟化型氟骨癥，而且成骨細胞抑制與過量氟誘導的氧化應激密切相關〔3，4〕。體內外研究亦證實〔4，14〕，某些外源性抗氧化劑可清除氟誘導產生的自由基，同時提升組織細胞內抗氧化酶活力，進而減弱氟對組織細胞的氧化損傷。另外，細胞凋亡是在某種生理或病理條件下，細胞按照自身既定程序自主有序的死亡形式。本研究鏡下觀察發現，在NaF誘導下，成骨細胞呈現出核固縮、染色質濃縮邊集和廣泛線粒體腫脹等典型的細胞凋亡形態特征，而且在抗氧化物質MPPP的干預下，細胞凋亡程度有所減輕，與多項報道結果一致〔3，15〕。可見，高水平氟引起的氧化應激及其誘導的細胞凋亡，已成為抑制成骨細胞增殖的重要原因之一。

MPPP是從新品種玉米的紫色植株中提取，其花色苷類色素含量高達90%以上〔6〕，且具有較強的抗氧化活性〔7～9〕。與 Jin 等〔4〕研究結果相似，本實驗發現，MPPP可通過增強成骨細胞內的T-AOC抑制來自H2O2和NaF的氧化損傷，同時促進細胞增殖。這主要與花色苷類物質直接和(或)間接抗氧化機制有關:一是從化學結構上分析，花色苷存在酚羥基，可直接供氫抗氧化;二是通過核因子相關因子2的參與直接作用于DNA反應元件，誘導相關的抗氧化酶高表達〔16〕。此外，隨著年齡的增大，機體代謝能力減弱，組織細胞自由基不斷積累〔17〕，這就加重了氟骨癥的發生發展。因此推測，針對年長者，適量攝入抗氧化食品，在延緩衰老和緩解氟中毒癥狀方面將發揮積極作用。

總之，MPPP可通過提升成骨細胞T-AOC抑制NaF誘導的氧化損傷，提示富含花色苷的MPPP在氟骨癥的防治領域具有一定的應用價值。