白龍靈沙湯對小鼠Lewis肺癌MMP-2、TIMP-2及MVD表達的影響

胡志萍 甘 寧 陳煥朝 李澤浩 江建平 付皓云(湖北省腫瘤醫院中西醫結合科，湖北 武漢 430079)

肺癌的發病率與死亡率均呈上升趨勢〔1〕，癌癥的預防和治療已成為臨床迫切需要解決的問題之一〔2〕。手術或放化療雖然能夠控制腫瘤進展，但副作用較大，中醫藥在抗腫瘤研究治療方面有顯著效果，特別在抑瘤、增效減毒、預防復發和轉移等方面，彌補了肺癌手術、放化療治療的不足〔3〕。白龍靈沙湯在臨床中應用多年，是對非小細胞肺癌的治療有效方劑，前期研究表明白龍靈沙湯可提高患者的免疫功能〔4〕，本研究采用免疫組化的方法，分析白龍靈沙湯對小鼠Lewis肺癌基質金屬蛋白酶(MMP)-2、組織金屬蛋白酶抑制物(TIMP)-2及微血管密度(MVD)表達的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡雄性C57BL/6小鼠50只，體重(20±2)g，由湖北省實驗動物研究中心提供。所有動物均飼養于清潔級動物房，實驗過程中動物自由攝食和飲水，室溫20～25℃，濕度40%～70%。

1.2 藥物及試劑 白龍靈沙湯藥物組成(成人1日劑量):白英 30 g，龍葵 30 g，靈芝 10 g，沙參 15 g，補骨脂10 g;將中藥浸泡0.5 h后煮沸煎制約0.5 h，紗布過濾后文火煎制，濃縮濾液，使含生藥3.333 g/ml;兔抗-TIMP-2抗體、兔抗-bFGF抗體、兔抗-MMP-2抗體、兔抗-CD34抗體均由北京博奧森生物技術有限公司提供(貨號分別為 bs-0416R、bs-0217R、bs-20706R、bs-0646R)。

1.3 儀器 正置顯微鏡(OLYMPUS公司)，石蠟切片機(徠卡顯微系統有限公司)，攤片機(湖北康強醫療器械有限公司)，IMS圖像分析系統(武漢華聯科生物技術有限公司)。

1.4 分組 40只雄性C57BL/6小鼠在實驗室穩定條件下飼養1 w后，隨機分成模型組，白龍靈沙湯高、中、低劑量組，每組10只。

1.5 Lewis肺癌模型建立 無菌條件下操作，取傳代好的帶瘤小鼠的實體瘤塊，用剪刀剪成小碎塊，用套管針移植或用玻璃勻漿器加生理鹽水(1∶1.5)磨成勻漿，計數用2.5 ml漿液中的瘤細胞，用生理鹽水研磨并調整細胞數到1×107/ml，每只0.2 ml用右腋部皮下接種。

1.6 給藥方法 各組于腫瘤接種后次日開始給藥。白龍靈沙湯高、中、低劑量組分別按白龍靈沙湯成人日推薦劑量的20倍、10倍、5倍換算給藥量，即高劑量組33.33 g·kg－1·d－1，中劑量組 16.67 g·kg－1·d－1，低劑量組8.33 g·kg－1·d－1。模型組予等體積雙蒸水灌胃，1次/d，連續28 d。末次給藥24 h后取材進行指標檢測。

1.7 一般情況觀察 觀察各組小鼠精神狀態、活動狀況、對刺激的反應、體重下降幅度、食欲和脫毛等指標。

1.8 瘤重、抑瘤率檢測 末次給藥24 h后將小鼠頸椎脫臼處死，完整剝離腫瘤體后稱重(W)，計算抑瘤率(I):I=(模型組W－治療組W)/模型組W×100%。

1.9 免疫組化染色法檢測MMP-2和TIMP-2表達瘤體取下后經甲醛固定48 h，梯度酒精脫水、浸蠟，石蠟包埋切片4張，切片厚度4 μm。切片脫蠟、水化。水浴法進行抗原修復，pH6.0，檸檬酸緩沖液加熱至95～99℃，放入切片30 min，然后室溫下靜置20 min，取出切片，磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗待用;顯色劑顯色。MMP-2和TIMP-2均以血管內皮及間質細胞中出現棕黃色顆粒為其陽性細胞。每張切片中取具有陽性顆粒數目最多的5個間質區視野(400×)，用IMS圖像分析系統定量檢測陽性顆粒的面積、平均光密度來表示其在瘤體中的表達量。

1.10 免疫組化染色法檢測MVD表達 微血管檢測用抗細胞黏附分子CD34標記血管內皮細胞，以內皮細胞胞質中出現棕黃色顆粒的微血管為陽性微血管。結果判斷:在低倍視野內(100×)找到腫瘤組織內MVD最高的區域，然后在高倍視野內(400×)通過計算機圖像分析系統在監視器上計數微血管的數目，凡呈現棕色單個細胞或細胞簇者均作為1個血管計數單位，管腔面積大于8個紅細胞直徑的血管不計數。每張切片在400倍視野下計數5個視野，取平均值。

1.11 統計學分析 用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析，方差檢驗齊性者用LSD法，方差不齊者用Games-Howell法檢驗。

2 結果

2.1 一般情況觀察 各組小鼠接種前及給藥前一般情況無差異，各受試小鼠自接種腫瘤后均出現不同程度的生長。模型組腫瘤體生長較快，高劑量組生長最慢。給藥7 d后模型組和低劑量組逐漸出現精神萎靡，對外界刺激反應下降，活動減少，進食量有所減少，皮毛光澤度不佳。至給藥28 d實驗結束時，模型組小鼠活動進一步減少，對外界刺激反應遲鈍，每日進食量少，喜扎堆生活，體質量下降，毛色干燥晦暗無光澤甚至干枯脫落。高劑量組小鼠活動無明顯減少，對外界刺激反應較為敏感，每日進食量有一定減少但不明顯，毛色相對較有光澤。中、低劑量組表現差不多。整個實驗中無死亡。

2.2 各組W、I比較 給藥28 d后，與模型組比較，各治療組平均W均一定程度降低，差異有統計學意義(P＜0.01)，而與白龍靈沙湯低劑量組相比，白龍靈沙湯中、高劑量組明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。白龍靈沙湯中、高劑量組平均I高于白龍靈沙湯低劑量組，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

表1 各組W、I比較(，n=10)

表1 各組W、I比較(，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.01;與白龍靈沙湯低劑量組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01;下表同

組別 W(g) I(%)模型組 8.49±1.63 －白龍靈沙湯高劑量組 3.08±0.711)3) 62.92±13.153)白龍靈沙湯中劑量組 4.03±0.861)2) 52.03±8.642)白龍靈沙湯低劑量組 5.87±1.131) 45.76±9.33

2.3 各組MMP-2表達比較 給藥28 d后，與模型組比較，各治療組MMP-2表達陽性面積、平均光密度均顯著降低(P＜0.01);與白龍靈沙湯低劑量組比，中、高劑量組顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

表2 各組MMP-2、TIMP-2、MVD表達比較(，n=10)

表2 各組MMP-2、TIMP-2、MVD表達比較(，n=10)

組別 MMP-2TIMP-2陽性面積(mm2) 平均光密度/IOD 陽性面積(mm2) 平均光密度/IOD MVD(mm2)模型組 6 015.3±1031.2 0.369±0.059 1 649.3±294.5 0.195±0.038 87.16±16.19白龍靈沙湯高劑量組 3 017.2±493.61)3) 0.208±0.0311)3) 3 397.5±681.71)3) 0.307±0.0571)3) 46.16±8.681)3)白龍靈沙湯中劑量組 3 291.8±501.61)3) 0.221±0.0381)3) 3 164.2±583.41)2) 0.289±0.0421)2) 49.22±9.051)3)白龍靈沙湯低劑量組 4 371.6±783.11) 0.291±0.0451) 2 894.6±520.61) 0.271±0.0491) 53.64±10.421)

2.4 各組TIMP-2表達比較 給藥28 d后，與模型組比較，各治療組TIMP-2表達陽性面積、平均光密度顯著升高(P＜0.01);與白龍靈沙湯低劑量組比，中、高劑量組均顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

2.5 各組MVD表達比較 給藥28 d后，與模型組比較，各治療組MVD均顯著降低(P＜0.01);與白龍靈沙湯低劑量組比，中、高劑量組一定程度降低，差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2。

2 討論

肺癌在全球總體發病率已位居各類癌癥之首，在我國肺癌發病率居惡性腫瘤之首，其中男性為第一位，女性為第二位〔5〕。祖國醫學對于肺癌的治療積累了豐富的經驗，在改善肺癌患者的生活質量、延長患者的生存期方面有明顯優勢。白龍靈沙湯方中白英味甘、苦，性寒，具有清熱解毒、祛風除濕、利水消腫之功效;龍葵味苦性寒，具有清熱解毒、活血消腫的功效;靈芝味甘，性平，具有補氣安神、止咳平喘的功效;沙參味甘微苦，性微寒，具有養陰清肺、益胃生津的功效;補骨脂味苦，性辛溫，具補腎健脾納氣的功效，諸藥共奏扶正消瘤之效。

腫瘤的生長和轉移是一個復雜的多步驟過程，受諸多因素影響。近年研究發現，實體癌的生長和轉移需要持續的血管生成，有關腫瘤血管生成與腫瘤的生長、轉移及預后等關系已引起許多學者的關注，研究發現〔6～8〕MVD 與腫瘤的轉移、復發、預后等關系密切，是一個反映惡性腫瘤生物學行為的重要參數。

腫瘤細胞及微環境分泌的生物因子在腫瘤的復發和轉移過程中扮演重要角色。研究表明，腫瘤的復發及轉移首要條件為腫瘤細胞必須具有降解細胞外基質的能力〔9，10〕。MMPs是降解細胞外基質的主要成分之一，其中 MMP-2是 MMPs家族中的關鍵作用因子〔11，12〕，研究表明〔13，14〕，MMP-2 和 TIMP-2 可能均參與了非小細胞肺癌新血管生成的調節。

本實驗中模型組小鼠進食、活動、體質、體重、對外界刺激等一般精神狀況較差，而各治療組小鼠一般狀況優于模型組，且呈劑量相關，高劑量組與給藥前變化不大，與臨床〔4〕相吻合。

本實驗結果表明，肺癌的發生是一個極其復雜的過程，白龍靈沙湯作為復方制劑對于肺癌的作用可能是多方面的，本實驗從對肺癌組織中MMP-2、TIMP-2及MVD的影響方面探討了白龍靈沙湯的抑瘤作用，對該方的臨床應用提供理論依據。