腦缺血后處理通過調控細胞周期改善大鼠缺血性腦卒中損傷

劉 瑤 韓 影 趙雅寧 周 娜 (華北理工大學護理與康復學院，河北 唐山 063000)

缺血性腦卒中是臨床的常見病和多發病。腦缺血后處理(CIP)是指在缺血再灌注后一定時間內，給予1次或多次短暫性缺血再灌注，使組織對缺血產生耐受性〔1〕。CIP是缺血再灌注損傷較有力的內源性保護機制，在臨床上缺血性心、腦及外周血管疾病的防治具有良好的應用前景。細胞周期指連續分裂的細胞從上一次有絲分裂結束開始到下一次有絲分裂結束為止所經歷的整個序列過程。張貴斌等〔2〕在腦缺血再灌注大鼠模型中發現細胞周期參與神經元壞死的過程。已有研究發現CIP可通過調節細胞周期調控因子的表達，修復損傷的心肌組織〔3〕。但CIP對中樞神經系統的保護作用是否與調控細胞周期有關，目前報道甚少。細胞周期蛋白(Cyclins)和細胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)是細胞周期調控的關鍵成分，CyclinD1和CDK4的表達是評估缺血神經元是否進入病理狀態細胞周期的關鍵指標〔4〕。本文通過檢測 CyclinD1和CDK4的表達，探究CIP腦保護的作用，為缺血性腦卒中的治療提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 清潔級健康雄性SD大鼠96只，體質量300～350 g，購自北京維通利華實驗動物中心，于華北理工大學醫學實驗中心飼養。在模型制造之前讓大鼠適應7 d環境，自由進食飲水，溫度22～26℃，濕度40%～70%，空氣壓力梯度20 Pa。將96只大鼠采用隨機數字法分為假手術組(Sham組)、腦缺血再灌注模型組(CIR組)、CIP組。

1.2 主要試劑 CyclinD1兔抗鼠多克隆抗體、CDK4兔抗鼠多克隆抗體和二抗(山羊抗兔)由武漢博士德生物工程有限公司提供，Nikon攝影生物光學顯微鏡購自日本株式會社尼康，伯樂電泳轉印系統、凝膠成像系統來自美國Bio-Rad公司。

1.3 動物模型制作 使用四血管閉塞法(4-VO)〔5〕制作全腦缺血再灌注模型。動物常規麻醉，頸正中切口，分離雙側頸總動脈，并分別置線標記備用。其后將大鼠枕后部正中切開，暴露雙側第一頸椎橫突翼孔，熱凝其下通過的椎動脈，電凝每次時間2～4 s，將翼小孔后雙側椎動脈永久閉塞。常規消毒縫合傷口，單獨放回籠中，造模后24 h，在大鼠清醒狀態下夾閉兩側的頸動脈20 min，實行再灌注，最后完成縫合。CIP組大鼠首先同CIR組大鼠采用改良的Pulsinelli 4-VO制作大鼠全腦缺血模型，實現永久再灌注之前，進行松開動脈夾15 s，再夾閉15 s，如此進行3次缺血/再灌注循環，實現CIP。Sham組分離暴露血管，但不電凝椎動脈、不夾閉頸總動脈。缺血再灌注后6、24、48、72 h進行蘇木素-伊紅(HE)染色免疫組化染色及Western印跡檢測。

1.4 水迷宮檢測 Morris水迷宮是檢測空間學習記憶功能的一種常用方法。需要對大鼠進行訓練，每日2～3次，連續3 d，每次訓練將大鼠面向池壁依次從4個象限的固定入水點放入水中，訓練其通過空間標志物尋找平臺的能力。正式試驗時往水池內注水使平臺藏于水面下方，再從某一個象限放大鼠進水池。電腦追蹤記錄大鼠從入水到登上站臺所需要的時間(潛伏期)和穿過平臺的次數以觀察其對平臺的記憶。設定1次游泳時間90 s，如果大鼠超過這個時間沒有找到隱藏在水下的平臺，將其引導至站臺，熟悉30 s。根據計算機的記錄儀記錄大鼠游泳的軌跡、逃避潛伏期及穿臺次數，并求各組均值。

1.5 HE染色 各組各時間點4只大鼠，規定時間以0.4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，開胸、暴露心臟，4%多聚甲醛行心臟灌流，斷頭取腦，4℃冰箱放置至少24 h。在視交叉后1～6 mm處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，連續冠狀切片，每只動物取5張海馬區切片，片厚4 μm。切片常規脫蠟至水，HE染色。選用Motic-6.0圖像采集及分析系統來計算每個視野的存活的神經元數，以平均細胞存活密度(存活細胞數量與總細胞數量比值)表示。

1.6 免疫組化染色 常規麻醉動物，開胸用4%多聚甲醛行心灌流，斷頭取腦，在視交叉后1和6 mm處冠狀面切開，取中間塊入4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片(片厚5 μm)。切片常規脫蠟至水，然后滴加一抗(CyclinD:1 ∶200;CDK4:1 ∶200)，濕盒中 4℃過夜，滴加二抗，37℃恒溫箱內孵育1 h;二氨基聯苯胺(DAB)顯色，脫水、透明、封片。光學顯微鏡(10×40倍)下觀察并計數組織中陽性細胞數，每個標本取5張切片，每個切片隨機選取不重復的視野3～5個，計數各個視野下的陽性細胞數量。

1.7 Western印跡檢測 處死大鼠后，迅速取雙側海馬區組織，4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，加入單去污劑裂解液(含PMSF)提取蛋白，4℃、12 000 r/min離心15min取上清。二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，將蛋白標準配制液0.8 ml和BSA蛋白標準混合配制成濃度為25 mg/ml的蛋白標準液。根據電腦繪制的標準曲線計算待測蛋白的濃度。100 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，封閉液中封閉至少1 h，加入 CyclinD1、CDK4(1∶500)與actin(1∶1 000)的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜，加二抗(1∶800)，37℃ 孵育 1 h，TBST 洗膜，電化學發光(ECL)顯色，采用數碼成像分析系統軟件分析各因子的平均灰度值，將目的因子和內參的平均灰度值的比值進行比較。

1.8 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 各組水迷宮檢測結果 與Sham組比較，CIR組在72 h的逃避潛伏期時間明顯延長、穿臺次數明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.05);與CIR組比較，CIP組相應時間點的潛伏期明顯縮短、穿臺次數明顯增加，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1、圖1。

表1 各組水迷宮潛伏期和穿臺次數比較(，n=12)

表1 各組水迷宮潛伏期和穿臺次數比較(，n=12)

與Sham組比較:1)P＜0.05;與CIR組比較:1)P＜0.05;下表同

組別 潛伏期(s) 穿臺次數(次)Sham 組 20.02±0.24 12.87±1.30 CIR 組 62.03±1.421) 2.97±1.261)CIP 組 45.96±1.461)2) 6.59±0.671)2)

圖1 水迷宮檢測各組大鼠學習記憶功能

2.2 各組海馬區神經元形態學變化 Sham組海馬區神經元結構完好、胞質淡染而均勻;CIR組海馬區神經元細胞核有明顯的固縮、碎裂征象，間質水腫，與Sham組比較，CIR組各時間點神經細胞存活率顯著降低(P＜0.05);CIP組各時間點神經元形態損傷程度減輕，胞質淡染，細胞核變性減輕，與CIR組比較，CIP組在各時間點存活神經元細胞數量增多(P＜0.05)。見表 2，圖 2。

2.3 各組海馬區CyclinD1免疫組化和Western印跡結果 免疫組化結果:CyclinD1陽性產物呈棕黃色染色，表達在細胞核中，Sham組偶見陽性細胞，CIR、CIP組有不同程度的陽性產物表達量，且隨時間陽性細胞逐漸增多，72 h達高峰。與Sham組比較，CIR組在各時間點CyclinD1的陽性細胞數顯著增加(P＜0.05);與CIR組比較，CIP組相應時間點 CyclinD1陽性細胞數量顯著降低(P＜0.05)。見圖3，表3。

表2 各組海馬區神經元存活率比較(，%，n=12)

表2 各組海馬區神經元存活率比較(，%，n=12)

組別 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 組 98.41±1.00 98.10±1.22 97.60±1.48 97.59±1.47 CIR 組 76.25±1.131)69.14±1.631)61.99±1.611)54.19±1.751)CIP 組 87.06±0.911)2)79.63±1.531)2)70.10±1.681)2)63.98±1.361)2)

圖2 各組24 h海馬區神經元形態結構變化(HE，×400)

圖3 各組24 h海馬區CyclinD1免疫組化染色結果(DAB，×400)

表3 各組海馬區CyclinD1陽性細胞數比較(，個/高倍鏡視野，n=12)

表3 各組海馬區CyclinD1陽性細胞數比較(，個/高倍鏡視野，n=12)

組別 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 組 3.24±1.28 3.17±0.99 3.31±1.24 3.30±1.18 CIR 組 11.06±0.701)15.55±0.861)22.23±1.071)29.66±1.191)CIP 組 7.03±1.211)2)11.15±1.071)2)17.35±0.931)2)25.09±0.881)2)

Western印跡分析結果:Sham組CyclinD1蛋白表達量較低，而CIR、CIP組隨時間延長表達量逐漸增加，72 h達高峰。與Sham組比較，CIR組在各時間點CyclinD1蛋白表達顯著增加(P＜0.05);與CIR組比較，CIP組在相應時間點CyclinD1蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。見表 4，圖 4。

表4 各組海馬區CyclinD1蛋白水平比較(，n=12)

表4 各組海馬區CyclinD1蛋白水平比較(，n=12)

組別 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 組 0.26±0.04 0.27±0.05 0.26±0.07 0.27±0.06 CIR 組 0.58±0.061) 0.75±0.091) 0.84±0.081) 0.89±0.091)CIP 組 0.35±0.081)2)0.43±0.091)2)0.56±0.061)2)0.63±0.071)2)

2.4 各組海馬區CDK4免疫組化和Western印跡結果

免疫組化結果:CDK4陽性產物表達在細胞核中，呈棕黃色染色，Sham組偶見陽性細胞，CIR、CIP組有不同程度的陽性產物表達量，且隨時間延長陽性細胞逐漸增多，72 h達高峰。與Sham組比較，CIR組在各時間點CDK4陽性細胞數量明顯增加(P＜0.05);與CIR組比較，CIP組相應時間點CDK4陽性細胞數量明顯降低(P＜0.05)。見表 5，圖 5。

圖4 Western印跡檢測各組基底動脈CyclinD1的表達

Western印跡分析結果:Sham組CDK4蛋白量較少，而CIR、CIP組隨時間延長表達量逐漸增加，72 h達高峰。與sham組比較，CIR組在各時間點CDK4蛋白表達顯著增加(P＜0.05);與CIR組比較，CIP組相應時間點CDK4蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)。見表 6，圖 6。

表5 各組大鼠海馬區CDK4陽性細胞數比較(，個/高倍鏡視野，n=12)

表5 各組大鼠海馬區CDK4陽性細胞數比較(，個/高倍鏡視野，n=12)

組別 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 組 3.30±0.73 3.25±1.41 3.40±1.76 3.45±1.57 CIR 組 10.10±1.551)16.45±1.261)23.60±1.311)29.60±2.081)CIP 組 5.80±1.421)2)11.40±1.351)2)19.25±1.031)2)25.45±1.251)2)

圖5 各組24 h海馬區CDK4免疫組化染色結果(DAB，×400)

表6 各組大鼠海馬區CDK4蛋白水平比較(，n=12)

表6 各組大鼠海馬區CDK4蛋白水平比較(，n=12)

組別 6 h 24 h 48 h 72 h Sham 組 0.20±0.04 0.23±0.03 0.22±0.04 0.22±0.06 CIR 組 0.50±0.091) 0.65±0.051) 0.73±0.071) 0.86±0.091)CIP 組 0.29±0.071)2)0.38±0.061)2)0.42±0.091)2)0.51±0.081)2)

圖6 Western印跡檢測各組基底動脈CDK4的表達

3 討論

CIP指在再灌注開始時對阻塞的血管進行短暫、重復的開通及再閉，隨后恢復血管血流的再通。CIP在心血管領域的研究已表明可以減少缺損面積，并已嘗試將其應用于臨床工作〔6〕。CIP的作用隨著研究的不斷深入在不同動物的肺、腎、肝等均得到證實〔7～9〕。2006年Zhao等〔10〕發現CIP具有促進神經功能恢復，保護腦功能的作用。本研究結果說明CIP對缺血性腦卒中起到了良好的保護作用。CIP作為一種內源性保護機制，腦保護作用機制廣泛而復雜，對其機制研究已在多個水平上進行了相當多的工作，已發現CIP與避免氧自由基的過度產生、線粒體鈣超載、細胞外信號調節蛋白激酶信號通路等有關〔11～13〕。但是否還可以通過誘導細胞增殖，修復受損的海馬組織尚不清楚。

細胞周期分為G1期、S期、G2期、M期。細胞的發生發育有賴于細胞周期的正常運行，細胞周期是細胞分化與增殖的內在組分。細胞周期的進程主要是通過Cyclins和CDKs的調控而實現〔14〕。Cyclins在腦缺血中均有異常表達，而CDK4在腦缺血損傷中具有重要作用，抑制它的活性具有顯著的神經保護作用。Trimsit等〔4〕研究發現腦缺血后半暗帶神經元內 CyclinD1和CDK4的表達是評估缺血神經元是否再次進入細胞周期的關鍵標志。目前認為，CyclinD1/CDK4主要參與以非興奮性毒性為主的缺血/缺氧引起的神經死亡過程。CyclinD是聯系細胞微環境和細胞周期的紐帶。CDK具有催化底物磷酸化的活性，其主要作用是調控細胞周期的不同時相，從G1、S、G2到M期，完成循環。Katchanov等〔15〕研究發現在腦缺血再灌注大鼠模型中，內源性CDKI p16INK4a的缺失可導致紋狀體神經元遲發性死亡;表明細胞周期與神經元損傷之間存在聯系。本研究結果說明CIP可能是通過降低全腦缺血大鼠海馬區CyclinD1、CDK4的表達從而起到調控細胞周期而保護神經元的作用。缺血性腦卒中后細胞周期出現紊亂，與產生大量氧自由基、出現氧化應激有關。劉靜〔16〕對人胃黏膜細胞(GES)-1細胞加用抗氧化劑后，細胞內活性氧減少，氧化應激降低同時緩解了細胞周期阻滯現象。而缺血后處理的重要保護機制抑制即為氧自由基的堆積，維持活性氧清除系統的平衡〔17〕。本研究結果提示，CIP可能是通過抑制氧化應激而下調細胞周期因子CyclinD1和CDK4蛋白的表達，從而實現對細胞周期的調控。

綜上，CIP在腦缺血再灌注損傷后加速神經細胞再生修復的機制可能與影響Cyclin及CDKs的表達有關，從促進細胞周期進展進而加快神經細胞再生修復的途徑切入，為腦缺血再灌注損傷的防治提供新思路。