基因突變與中國原發性骨髓纖維化臨床特征及預后

張正玲 魏 巍 潘 靜 孫園園 艾麗梅 (錦州醫科大學附屬第一醫院血液內科，遼寧 錦州 121001)

ph陰性骨髓增殖性腫瘤(MPN)的典型代表包括真性紅細胞增多癥(PV)、原發性血小板增多癥(ET)和原發性骨髓纖維化(PMF)〔1〕。許多研究結果表明，疾病進展和急性髓系白血病(AML)轉化仍然是PMF患者預后不良的重要原因及治療的重點和難點〔2～5〕。JAK2V617F和MPL515L是PMF患者最常見的常規分子改變事件，目前已被作為診斷和治療的依據納入新的PMF診斷標準〔6～8〕。最新研究發現 CALR突變常見于發生在JAK2突變或MPL突變陰性的PMF患者中〔9～12〕。研究表明，90%以上的 PV 患者，50%～70%的ET或PMF患者可檢測到攜帶JAK2基因突變〔1，13～16〕;4%的ET 和8%PMF 患者攜帶有MPL515 基因突變〔17〕;15%～32%ET和25%～35%的PMF患者可見有 CALR-exon9插入或缺失突變〔18，19〕。但目前研究還沒能完全解釋攜帶何種基因突變的PMF患者更容易在治療過程中出現疾病進展并最終導致不良預后〔16〕。國際上既往研究關于JAK2/CALR/MPL基因突變對PV、ET和PMF的臨床特征、生存時間情況和繼發 AML 影響的研究資料較多〔2，3，20〕，但有關 JAK2/CALR/MPL基因突變在中國PMF患者的特征及疾病進展預后中作用的報道較少。本研究在Bai等〔21～23〕研究前期工作的基礎上，分析中國PMF患者JAK2/CALR/MPL基因突變與PMF臨床特征和預后的相關性。

1 對象與方法

1.1 病例選擇 回顧性分析1983年8月至2014年11月就診于中國醫學科學院血液病醫院，年齡＞18歲的PMF患者175例，男79例，女96例，中位年齡55(18～83)歲。PMF和AML的診斷標準均嚴格依據2008年世界衛生組織(WHO)標準〔13〕。所有患者通過門診隨訪、電話隨訪或隨訪信件的方式進行信息確認。本研究獲得錦州醫科大學及中國醫學科學院血液病醫院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 等位基因特異性PCR檢測JAK2V617F 應用巢式等位基因特異性PCR檢測JAK2V617F突變情況。引物如下:P2:5'-CCTCAGAACGTTGATGGCA-3'，P2r:5'-ATTGCTTTCCTTTTTCACAAGA-3'，Pnf: 5'-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATG-3'，Pmr:5'-GTTTTACTTACTCTCGTCTCCACAAAA-3'。PCR 產物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外燈下分析，產物為453 bp、279 bp和 229 bp 3種類型。279 bp為JAK2V617F突變型產物，229 bp為野生型產物。當DNA樣本含量較低時，先用引物 P1:5'-GATCTCCATATTCCAGGCTTACACA-3'和P1r:5'-TATTGTTTGGGCATTGTAACCTTCT-3'預擴增獲得521 bp大小的產物，再取1 μl預擴增產物用上述巢式PCR進行二次擴增〔24〕。

1.3 Sanger測序 采用Sanger進行突變基因的序列測序檢測JAK2外顯子12，CALR外顯子9，MPL外顯子10編碼序列突變。PCR擴增體系為 50 μl，含200 ng模板DNA、上下游引物各200 nmol，剩余體積用Platinum PCR Super Mix(Invitrogen)補足。PCR擴增條件為CALR:95℃ 5 min;94℃ 30 s，67℃ 30s(每循環降低 1℃)，72℃ 30 s，10 個循環;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，29個循環;72℃ 10 min;10℃保存。MPL和JAK2:95℃ 10 min;95℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，40個循環;72℃ 10 min;JAK2V617F:95℃ 5 min;95℃30 s，54℃ 25 s，72℃ 30 s，35 個循環;72℃ 10 min，PCR產物由北京天一輝遠公司進行純化測序，測序結果應用DNASIS MAX軟件進行分析，所有突變樣品用正常基因序列進行證實。

1.4 分組 根據臨床診斷和基因突變類型將PMF患者分為 CALR突變的 PMF(CALR組)18例;JAK2V617F突變的PMF(JAK2V167組)88例;CALR/JAK2/MPL基因突變全陰(三陰組)的PMF 64例共3組(MPL突變僅5例，未統計)。

1.5 統計學分析 PMF患者總生存(OS)時間定義為診斷PMF至死亡或末次隨訪的時間。應用SPSS17.0軟件進行分析;非正態分布數據應用中位數(范圍)描述。定性變量用Fisher確切概率法;連續變量用獨立樣本t檢驗，影響PMF生存的危險因素，應用多因素Cox回歸分析。

2 結果

2.1 PMF的總體臨床特征 175例PMF患者中，中位隨訪時間5(1～25)年，預計生存時間15.2年，共34例死亡，死亡率為19.4%。175例患者年齡＞60歲49例(28.0%)，平均白細胞計數(WBC)為(13.13±12.76)×109/L，平均血紅蛋白(Hb)為(107.98±27.30)g/L，平均血小板計數為(473.87±320.31)×109/L。繼發AML的發生率為13.7%(34/175)，染色體異常發生率為7.4%(13/175)，Hb＜100 g/L 69例(39.4%)，WBC＞11×109/L 25 例(14.3%)，血小板＞1 000×109/L 24 例(13.7%)，外周幼稚細胞＞1%106例(43.4%)。

12例單用羥基脲治療，18例應用干擾素加羥基脲治療，16例單用干擾素治療，127例應用烷化劑、沙利度胺、雄激素等的治療，2例應用中藥(具體不詳)治療。24例(13.7%)PMF患者轉化為AML。

2.2 JAK2V617F突變、CALR突變或基因突變三陰與PMF患者臨床特征相關性 與JAK2V617F組比較，CALR組血小板稍高，Hb含量較低，WBC較低，但差異無統計學意義(P＞0.05);三陰組表現為較低的Hb含量和較低的WBC(均P＜0.001);對比三陰組，CALR組有較高的血小板數，較高的Hb含量及較高的WBC(P＜0.05)。各組異常染色體核型發生率、白血病轉化率差異無統計學意義(P＞0.05)。三陰組死亡率明顯高于JAK2V617F組和 CALR組(P＜0.05)，JAK2V617F組與CALR組差異無統計學意義(P=0.804)，見表 1。

2.3 基因突變狀態與PMF患者的生存情況 基因突變三陰的PMF患者生存最差。CALR組生存時間最長，為14.778年，JAK2V617F組次之，為14.757年，三陰組最短，為10.829年(圖1)。相對JAK2V617F組、CALR組，三陰組生存時間較差(P=0.011，0.049);JAK2V617F組較CALR組生存差，但差異無統計學意義(P=0.734)。

Cox多因素分析顯示，年齡＞60歲(OR=0.270，95%CI:0.135～0.539，P＜0.01);Hb＜100 g/L(OR=0.986，95%CI:0.973～0.999，P=0.042);WBC＞11×109/L(OR=2.377，95%CI:1.110～5.091，P=0.026);外周血幼稚細胞＞1%(OR=0.844，95%CI:0.570～1.250，P=0.048)和基因突變三陰(OR=3.314;95%CI:1.657～6.626，P=0.001)是影響 PMF生存的不良危險因素。

表1 JAK2V617F突變、CALR突變、基因突變三陰與PMF的相關性()

表1 JAK2V617F突變、CALR突變、基因突變三陰與PMF的相關性()

臨床特征 JAK2V617F組(n=88) CALR組(n=18) 三陰組(n=64) P值JAK2/CALR JAK2/三陰 CALR/三陰Hb含量(g/L) 117.17±24.15 109.17±18.20 95.36±28.41 0.120 ＜0.01 0.017 WBC(×109/L) 18.02±15.38 12.58±8.51 7.19±5.40 0.149 ＜0.01 0.012血小板計數(×109/L) 524.03±158.34 664.22±236.87 368.28±173.89 0.322 0.067 0.021染色體異常率〔n(%)〕 6(6.8) 1(5.6) 5(7.8) 0.854 0.819 0.749白血病轉化率〔n(%)〕 9(10.2) 1(5.6) 13(20.3) 0.600 0.076 0.109死亡率〔n(%)〕 12(13.6) 2(11.1) 19(29.7) 0.804 0.014 0.048

圖1 不同基因突變類型PMF患者的生存曲線

3 討論

Tefferi等〔25〕研究表明，CALR基因突變的PMF患者表現為較高的血小板數，較低的Hb計數和較好的生存時間〔18，19，26，27〕。基因突變三陰的 PMF 患者則具有較差的生存和較高的白血病轉化率〔9，25，28〕。

本研究中不同基因突變的患者間生存情況與Tefferi等〔9，25，28〕的研究結果類似，即在中國 PMF 患者中，基因突變全陰的PMF患者預后最差，故基因突變三陰的PMF患者中可能存在其他基類型的基因突變，應加強基因突變全陰的PMF患者的干預和治療強度。

本研究中，MPL突變在PMF患者中發生較低〔16〕，無法分析其與預后的相關性，故未納入統計。原因可能有以下兩點:一是所選取的病例數較少，存在一定偏差;二是MPL突變率較低可能是中國PMF患者的另一特征，下一步將擴大病例數進一步研究分析MPL突變對PMF患者臨床及實驗室特征的影響。

總之，將JAK2/CALR/MPL基因突變結合WHO標準的進行PMF診斷會更加精細，且基因突變檢測對判斷PMF預后及明確其發病的分子機制至關重要。下一步將進行JAK2V617F突變負荷檢測，進一步明確不同突變負荷對PMF患者臨床特征、疾病轉化與預后的影響。