低場核磁共振技術在魚用凍干疫苗保護劑篩選中的應用

陳 暉, 陳思謹, 洪碧紅, 彭 會, 洪 專, 易瑞灶

(1 廈門大學環境與生態學院，近海海洋環境科學國家重點實驗室，福建 廈門，361005； 2 國家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門，361005；3 福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心，福建 廈門，361005)

作為魚病防治最有效的方式，疫苗的使用避免了目前廣泛使用的化學藥物或者抗生素造成的環境問題和健康問題，可以更加安全有效地預防水產養殖魚類傳染性病害的發生[1-2]?；钚砸呙绱蠖鄬崦舾?，通常采用冷凍干燥的方式進行干燥。糖及其衍生物能夠維持凍干蛋白制劑的穩定，防止蛋白質失活和變性[11-12]，是凍干過程中常用的保護劑。近年來的研究表明，糖及其衍生物的保護作用與其較強的水分結合能力密切相關。水是引起藥物制劑不穩定的重要因素之一，高水分含量會加速蛋白質變性。制劑中的水分可分為結合水、不易移動的水和自由水[8,10]，而影響藥物穩定的主要是自由水。因此，在冷凍干燥過程中應當篩選合適的保護劑，盡量減少自由水的含量[6]。低場核磁共振(LF-NMR)作為一種水分測定的新技術，基于甲氫(H)質子核磁性質的不同而能夠區分不同狀態的水[15]。這種方法快速、無損、無創、預處理少，越來越廣泛地應用于牛肉、水果、面包等食品中或保水劑中水分狀態和分布的研究[13,16-19]，但將其應用于凍干保護劑的篩選尚未見報道。

本研究旨在比較不同凍干保護劑中水分的狀態及其分布，進而比較其水分結合能力，以期了解其與水的相互作用，通過選擇合適的凍干保護劑或優化凍干工藝參數，獲得更穩定的凍干疫苗產品。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

無水蔗糖、乳糖、右旋糖酐40、甘露醇和二水合海藻糖均購于Sigma公司(中國)。冷凍干燥機，Lyobeta25(西班牙 Telstar公司)；金屬浴，OSE-H(中國 天根公司)；X射線衍射儀，Smartlab 3KW(日本 Rigaku公司)；卡氏水分測定儀，890 Titrando(瑞士 Metrohm公司)；低場核磁共振(LF-NMR)分析儀，PQ01(中國 蘇州紐邁公司)；藥物穩定性試驗箱，ICH 260(德國 MeMelt公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

用高純水配制成質量體積比為10%的樣品，采用15 mL凍干瓶，每瓶裝樣4 mL，溶液的高度約為1 cm。預凍：擱板以2 ℃/min的速率降溫至-40 ℃，保持2 h；主干燥：真空度為0.2 mbar，-10 ℃下干燥6 h；二次干燥：溫度為37 ℃或4 ℃，干燥4 h；各干燥步驟之間加熱速率為0.2 ℃/min。凍干結束后，樣品立即密封，室溫保存。樣品測定之前用40 ℃金屬浴快速加熱，開封后立即進行測量。

1.2.2 晶型分析

使用CuKa1靶，波長λ=1.540 6 ?，塑膠平板放置樣品，5°～80°連續掃描，步進0.02°，分析時長8 min，采用D/Tex 一維高速探測器在室溫下進行試驗，收集數據。

1.2.3 水分含量測定

精密稱取0.5 g凍干樣品，攪碎后立即加入滴定器中。以10 mg超純水為校準液，利用TIAMO 2.3軟件自動計算數據。

1.2.4 水分分布分析

精密稱取1 g凍干樣品，攪碎后放入直徑為2.5 cm、高度為30 cm的玻璃管中，確保樣品的高度不超過2 cm，然后將管子插入LF-NMR分析儀中。采用CPMG序列測量樣品橫向弛豫時間T2。CPMG參數如下：譜寬(SW)200 kHz、回波時間(TE)0.08 ms；脈沖寬度90(P1)和180(P2)分別為4.48和10.48 LS；等待時間(TW)10 000 ms；射頻延遲時間(RFD)0.1 ms；模擬增益(RG1)20 db；數字增益(DRG1)3。在32 ℃下進行128次重復掃描，獲得500個回波的數據。采用MUXEXP分析軟件進行分析[15,20]。

1.2.5 吸濕性測試

精密稱取1 g凍干樣品，置于藥物穩定性試驗箱中，設定溫度(25±2)℃，相對濕度為(43±5)%，每12 h稱重，直至質量穩定，以穩定后的樣品質量計算吸水率，計算公式如下：

X=100%×(M2-M1)/M1

(1)

式中：X—吸水率；M1—放置前樣品質量，g；M2—放置后樣品質量，g。

2 結果與討論

2.1 凍干保護劑中的水分含量

在冷凍干燥過程中，最終產物的水分含量與二次干燥溫度密切相關，溫度越高，含水量越低[6]?？紤]到4 ℃和37 ℃分別為一般凍干制品二次干燥的溫度的下限和上限，為了獲得水分含量差異較大的樣品，選擇了這兩個溫度作為不同的二次干燥溫度。從圖1中可以看出，樣品中的水分含量隨著二次干燥溫度的升高而減少，相同溫度下甘露醇的含水量低于其它糖類。通過設定不同的二次干燥溫度，能夠獲得不同含水量的凍干樣品。

圖1 不同二次干燥溫度下凍干保護劑中的水分含量

2.2 凍干保護劑的晶型分析

X射線粉末衍射(XRPD)是最直接的形態學分析方法。根據布拉格衍射方程，當衍射發生時，兩個晶面(2 dsinθ)的光程差應該是波長(λ)的整數倍。通過將X射線相對衍射強度(I/I0)與衍射角2θ作圖，可以得到樣品的物理形態和結晶度等結構數據。采用這一方法，對在4 ℃下干燥的保護劑樣品形態進行了分析。圖2可見，在衍射角連續變化過程中，凍干海藻糖、蔗糖、乳糖和右旋糖酐均表現出彌散峰，沒有明顯的衍射峰，表明其中沒有晶體結構。而甘露醇具有明顯的衍射峰，表明冷凍干燥后甘露醇為晶態，其出峰時間對應的衍射角中包含9.6°、16.5°、18°、25.7°等角度，與半水合甘露醇的典型衍射角相吻合[21]，表明其中存在半水合甘露醇。此外，凍干甘露醇在衍射角14.6°和16.8°處也有出峰，表明其中還含有β-多晶型物[21]。這一推論也與其實際含水率(2.5%)明顯低于半水合甘露醇理論含水率(4.71%)的結果相吻合。

圖2 X射線粉末衍射分析凍干保護劑的晶型

2.3 凍干保護劑中的水分分布

采用LF-NMR的方法對凍干保護劑中的水分分布進行分析，結果如圖3所示。水分子中氫質子的T2(橫向)弛豫時間表示了水分子的狀態及周圍的物理化學環境[22]。在之前凍干大豆抗氧化肽的研究中[15]，根據LF-NMR測得的弛豫時間，其中的水被分為強結合水、弱結合水、不易移動水和自由水四種狀態,其中最后兩種狀態的水分子具有高度的自由度。

圖3所示，二水合海藻糖(Tre-di)中只有一種形態的水，其弛豫時間T21<1 ms，?？紤]到二水合海藻糖中結晶水分子與海藻糖分子緊密結合的性質，可以認為這一形態的水屬于結合水，參考之前的研究[15,17,23]，將1 ms作為結合水T2弛豫時間的上限。

當二次干燥溫度為4 ℃時，凍干蔗糖和甘露醇中均出現了兩種形態的水。在甘露醇中，其弛豫時間T22和T23分別約為3.2 ms和24.5 ms；在蔗糖中，其弛豫時間約為3～100 ms。在之前的研究中[15,17,23]，T2弛豫時間>10 ms的水被認為是自由水，在1 ms和10 ms之間是不易移動水。由圖可見，在二次干燥溫度為4 ℃時，凍干甘露醇和蔗糖中不僅存在結合水，而且還存在不易移動水和自由水，其中蔗糖中結合水約占總水分含量的5.69%，甘露醇中這一比例為8.67%，在這兩種糖中結合水的比例遠小于不易移動水和自由水。

圖3 LF-NMR分析不同二次干燥溫度下凍干保護劑中的水分分布

當二次干燥溫度為37 ℃時，所有凍干樣品中僅存在一種形態的水，即弛豫時間小于1 ms的結合水。與4 ℃的干燥條件相比，蔗糖和甘露醇中結合水的峰面積變大，表明甘露醇和蔗糖中的部分水分隨著二次干燥溫度的升高發生了遷移。在這一過程中，不僅自由水解吸，而且一些自由水轉變為結合水。通常認為在二次干燥過程中，隨著干燥溫度和真空度的增加，水分將從結合水轉變成自由水[6]，而在本試驗中，甘露醇和蔗糖中的水分遷移規律正好相反。對于海藻糖、乳糖和葡聚糖，即使在4 ℃的二次干燥溫度下，凍干樣品中也僅有結合水殘留，二次干燥溫度的增加對最終產品水分分布的影響不大。這一結果表明，海藻糖、乳糖和右旋糖酐40對水的結合能力較強，甘露醇、蔗糖對水的結合能力較弱。

2.4 凍干保護劑的吸濕性

吸濕性反映了樣品對水分的結合能力。測試了二次干燥溫度為37 ℃的各種凍干保護劑的吸濕性，結果見表1。除甘露醇外，所有糖均具有吸濕性，蔗糖的吸水率最低(1.88%)，明顯低于其他保護劑(4.53%～8.54%)，而甘露醇則表現出失水性。

表1 二次干燥溫度為37 ℃的凍干保護劑吸濕性

為了深入了解吸收的水分與保護劑之間的相互作用，采用LF-NMR測定了吸濕后凍干保護劑中的水分分布，結果如圖4所示。從圖4中可以看出，除甘露醇外的各凍干保護劑能夠牢固地結合吸收的水分，形成結合水。結合水的增加量與吸濕量相一致。糖類吸水能力的強弱在很大程度上取決于其極性基團的分布及其對水的可接近性，水—水以及水—大分子之間相互作用的強度，甚至基質的結晶度和相對濕度[23]。在本研究中，右旋糖酐40表現出最強的吸濕性，意味著其具有最強的水分結合的能力，而在二糖中，海藻糖和乳糖的結合能力比蔗糖強，其原因可能與糖類分子結構有關。

圖4 凍干保護劑吸收的水分分布

半水甘露醇在室溫下有很強的失水傾向性[21]。在T2弛豫時間曲線中，表示結合水的T21面積減小，出現了代表自由水的T22，大約占總信號的40%。這意味著在這一環境中，半水甘露醇中的殘留水從結合水轉變為自由水，隨后部分蒸發到環境中。

水分含量是影響藥物穩定性的重要因素之一，它會引起藥物活性下降或者降解，影響最終藥品的療效[24-25]，因此，在干燥過程中控制水分的殘留量對于維持其穩定性至關重要,特別是對于干燥條件溫和的凍干樣品來說更是如此[6,26]。然而，在眾多凍干保護劑對于蛋白類藥物如HI-6載藥白蛋白納米粒[24]，人表皮生長因子(rhEGF)[27],酸性磷酸酶等[6]穩定作用的報道中，海藻糖的效果優于甘露醇，即便其制劑中含水量高于甘露醇。這意味著凍干保護劑不僅是通過限制殘余水分，更重要的是限制水分的活動性，從而發揮其保護作用。受限于傳統的水分分析方法如干燥失重法或卡氏水分測定法等只能測定樣品中的水分含量而無法判斷樣品與水分的結合能力強弱。

本研究采用食品領域中正逐漸得到應用的LF-NMR技術來測定凍干保護劑中的水分分布，進而判斷其水分結合能力。結果顯示，不論二次干燥的溫度是4 ℃或37 ℃，在凍干海藻糖、乳糖和右旋糖酐中都沒有自由水，說明其對水具有很強的結合能力，進而表現出強烈的吸濕性。而對于蔗糖和甘露醇，水分結合能力相對較低，表現在4 ℃或37 ℃的二次干燥溫度下進行干燥后，水分分布有明顯的不同。正是因為甘露醇無法牢固的結合制劑中的水分，所以制劑中總水分含量雖然低，但是其中存在有自由水，或者是存儲過程部分結合水轉變為自由水，從而加速了藥物的降解。因此含有甘露醇的藥物制劑穩定性不如海藻糖或右旋糖酐。這一結果也說明，含有蔗糖和甘露醇的藥物制劑在冷凍干燥過程中需要對干燥工藝特別是二次干燥溫度進行細致的研究，以便使其中的自由水能夠最大限度地解析出來，延長制劑穩定性。不同保護劑對水分結合能力的差別，可能與其在凍干后形成的物理結構有關[7,28]。對于甘露醇，凍干后形成的晶體結構導致其與晶體外的水之間具有較弱的結合力，而對于其他糖和葡聚糖，凍干后形成的無定形態使水溶解在其內，從而使其與水具有更強的結合力。

3 結論

凍干保護劑中存在3種不同形態的水分，采用LF-NMR的方法分別確認了這3種形態水的弛豫時間：1 ms以內為結合水，1 ～10 ms為不易移動水，10 ms以上為自由水。二次干燥溫度對甘露醇和蔗糖中殘留水分的分布有很大影響，隨著溫度的升高，自由水的含量減少。由于甘露醇半水合物存在，凍干甘露醇表現出強烈的失水傾向，當暴露在相對濕度43%、溫度25 ℃的環境中時，其部分殘留水分從結合水轉變為自由水，然后蒸發到環境中，而其他非晶態凍干保護劑吸收環境中的水并將其固定到結合水中。通過對常見凍干保護劑中水分分布的研究，對其水分結合能力有了更深入的了解，有助于更好地了解凍干保護劑對藥物的保護作用，在制劑配方中篩選合適的保護劑并優化凍干工藝以獲得更穩定的藥物制劑。

致謝:感謝蘇州紐邁分析儀器股份有限公司、日本理學公司廣州辦事處提供儀器和技術上的幫助。

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