好氧反硝化技術處理水產養殖廢水研究進展

黃志濤， 江玉立， 宋協法

(中國海洋大學水產學院，山東 青島 266003)

水產養殖過程中部分飼料在魚類消化、吸收等代謝過程中轉化為氨氮排泄到養殖環境，產生的殘飼、糞便也會在微生物作用下礦化為氨，進而轉化成亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮。循環水養殖過程中的生物過濾環節可以將水體中毒性較高的氨氮和亞硝酸鹽氮轉化成毒性較低的硝酸鹽氮，引起水體中的硝酸鹽積累，其質量濃度可達100 mg/L以上，甚至是500 mg/L以上[1]。研究表明，硝酸鹽氮對于養殖對象的毒害作用比同質量濃度的氨氮和亞硝酸鹽氮要低，但高質量濃度的硝酸鹽氮仍會導致魚類生長緩慢，存活率降低，免疫力下降[2-6]。含有高質量濃度硝酸鹽氮養殖廢水的排放，是自然環境水體富營養化的重要原因之一，因而應將循環水養殖系統中硝酸鹽氮的質量濃度控制在合理范圍內。

生物脫氮技術是目前處理水產養殖廢水的有效方式之一。實際生產中，養殖水體中的溶氧一般保持在4～8 mg/L。而傳統反硝化理論認為氧氣的存在會抑制反硝化酶活性，只有在缺氧或兼性厭氧的條件下反硝化酶才具有活性，生物反硝化過程才能進行。20世紀80年代，Robertson等[7]報道了好氧反硝化細菌和好氧反硝化酶系的存在，為水產養殖在有氧條件下去除硝酸鹽提供了一種嶄新的思路。近年來，隨著對生物脫氮研究的深入，好氧反硝化細菌的研究日益增多，但在水產養殖廢水處理方面應用研究較少。

本文介紹了好氧反硝化細菌的作用機理，分析了好氧反硝化細菌的影響因素，重點介紹了好氧反硝化細菌在水產養殖廢水處理中的應用現狀，指出存在的問題并對其前景進行展望，以期為水產養殖廢水反硝化的應用和推廣提供理論參考。

1 好氧反硝化作用機理探討

近年來，不同學者對于好氧反硝化作用機理存在不同的觀點，本文從微環境、生物化學和微生物3個方面對近幾年國內外學者所做的一些研究成果進行闡述。

1.1 微環境理論

微環境理論主要側重于從物理角度闡述好氧反硝化作用機理[8-9]，認為由于氧氣的擴散作用，微生物絮體內部或者生物膜表面會產生溶氧的質量濃度梯度，即微生物絮體表面溶氧的質量濃度較高，好氧硝化細菌發生反應，當深入絮體內部時，氧氣的傳遞受到阻礙，其微環境為缺氧區，厭氧反硝化反應占據優勢地位。當微生物反應池內溶氧質量濃度不高時，會使缺氧環境的比例有所升高，有利于反硝化作用的進行[10]。實際生產中，由于外部環境多變，微生物群落復雜以及電子傳遞不均勻等因素，使得在微生物絮體內或者生物膜表面產生多種微環境。

1.2 生物化學機理

1.3 微生物理論

1.3.1 協同呼吸理論

協同呼吸理論[13]認為，在好氧反硝化過程中，硝酸鹽和氧氣均可作為電子受體參與反應，細胞色素c和細胞色素aa3之間電子傳輸過程中的“瓶頸”可被克服，因而電子流就可以同時傳輸給反硝化酶和氧氣，故反硝化就可以在好氧環境中發生(圖1)。Huang等[14]也認為，氧氣和硝酸鹽氮同時存在時，反硝化作為輔助電子傳遞途徑，是對有氧呼吸的補充，可防止煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的大量積累。此外，細胞色素的氧化還原水平會控制電子流向不同的細胞色素，以確定電子是否能夠發生反硝化。Wilson等[15]提出的好氧反硝化過程中電子傳遞見圖1，反硝化細菌可以將電子從被還原的物質傳遞給O2，同時也可通過硝酸鹽還原酶將電子傳遞給硝酸根。

注：Nar為硝酸鹽還原酶；Nir為亞硝酸鹽還原酶；Nor為一氧化氮還原酶；Nos為一氧化二氮還原酶

1.3.2 好氧反硝化酶作用

好氧反硝化被認為是一個涉及4種酶，即硝酸鹽還原酶(Nar)、亞硝酸鹽還原酶(Nir)、一氧化氮還原酶(Nor)和一氧化二氮還原酶(Nos)的4步復雜生化還原反應。從好氧反硝化酶系角度闡述好氧反硝化機理開始于對泛養硫球Thiosphaerapantotropha[16](現更名為脫氮副球菌Paracoccusdenitrifications)的研究，在T.pantotropha內包含著膜內硝酸鹽還原酶(Nar)和周質硝酸鹽還原酶(Nap)，在好氧條件下，Nap優先被還原，而在厭氧條件下，Nap的活性被抑制，Nar活躍，被優先利用。Bell等[17]利用Nar對含氮化合物在不同條件下敏感性進行試驗，發現在厭氧環境下，90%的Nar活性被抑制，而在好氧的環境下，好氧生長細胞被抑制了25%。Nir主要有2種，一種是人們熟知的細胞色素cd1，由Nirs基因編碼；另一種是Nir，位于外周胞質，是一種可溶性含銅酶，由Nirk基因編碼。劉興等[18]研究銅綠假單胞菌YY24發現，該菌存在膜結合Nar，Nir類型為細胞色素cd1型Nir。Nos已在P.stutzeri、P.denitrifications等細菌中分離提純，其部分特征已被確定由Nor CB基因編碼[19]。好氧反硝化菌的Nos是一種含銅蛋白，位于膜外周質中[20]。Bell等[17]認為，在氧氣存在條件下脫氮副球菌細胞Nos具有活性，且能將NO、N2O兩種氣體同時還原。硝酸鹽降解過程是因為好氧反硝化菌菌體內依次產生Nar，Nir，Nor和Nos，最終生成氮氣。

2 好氧反硝化影響因素

影響好氧反硝化反應的因素有碳氮比(C/N)、溶氧(DO)、碳源、溫度、pH等，但不同的菌株種類、好氧反硝化反應器結構以及環境調控措施使得它們的影響能力各不相同。近幾年的研究表明，在水產養殖廢水處理中，反硝化主要受碳源、溶氧和碳氮比等因素的影響[12,14,21]。

2.1 碳源

碳源是細菌生長過程中必不可少的能量來源，碳源越充足，好氧反硝化速率越快，總氮去除率也越高[21]。孫慶花等[22]從海洋沉積物中分離出一株好氧反硝化細菌，即克雷伯氏菌Klebsiellasp.，發現以檸檬酸三鈉為碳源時，硝酸鹽氮的去除率為90.27%，且無亞硝酸鹽氮積累。Hamlin等[23]利用甲醇、乙酸、葡萄糖、水解的淀粉作為反硝化的碳源對西伯利亞鱘魚養殖水體進行凈化試驗，發現4種碳源均能有效地將硝酸鹽氮質量濃度從11～57 mg/L降至接近0的質量濃度，在不考慮碳源限制的條件下，每天最大的反硝化率為670～680 g/m3。白潔等[24]從膠州灣沉積物中分離出1 株異養硝化—好氧反硝化菌株Zobellellasp B307，在最優條件下考察其在單一和混合氮源中的脫氮效果，發現最佳碳源為丁二酸鈉，在最佳條件下對氨氮和硝酸鹽氮的去除率分別達到97.67%和94.39%。Duan等[25]研究發現好氧反硝化細菌VibriodiabolicusSF16的最佳碳源為乙酸鈉。Bernat等[26]利用活性污泥處理無碳源廢水，脫氮率為1.54 mg/L，而處理投加醋酸鈉的廢水，脫氮率達到22.50 mg/L，說明好氧反硝化細菌外源呼吸比內源呼吸效率高。可見好氧反硝化細菌最適宜的碳源不盡相同，這是由于碳源結構及分子量的差異導致菌株生長和脫氮效果的不同。

2.2 溶氧

溶氧通過抑制反硝化酶的合成、活性或者與硝酸鹽競爭電子供體等途徑影響好氧反硝化反應進程，對細菌的反硝化性能至關重要[27]。邵晴等[28]分離的好養反硝化細菌A1，在溶氧為5 mg/L時，對亞硝酸鹽的去除率高達99%，且反硝化主要發生在菌種生長的對數期。Huang等[14]認為溶氧是細菌進行好氧反硝化的關鍵因素，當溶氧為5 mg/L時，好氧反硝化細菌Citrobacterdiversus的反硝化速率最高，溶氧的升高和降低都會造成好氧反硝化速率的下降，原因可能是溶氧在閾值以上時氧氣對于反硝化酶有抑制作用。溶氧閾值[29]是區分厭氧反硝化與好氧反硝化的主要標志之一，該值越高，表明菌株對氧的耐受能力越強，即在高溶氧條件下仍表現出良好的反硝化能力。

2.3 碳氮比

水產養殖廢水通常是貧營養環境，所以需要額外添加碳源，因而碳氮比(C/N)在反硝化過程中起著重要作用。好氧反硝化的效率隨C/N的增加而提高，C/N的降低會減少反硝化基因表達，沒有足夠的碳源來合成反硝化酶，影響菌體生長以及硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的去除[29]。Guo等[30]對好養反硝化細菌HNR進行正交實驗表明，在C/N為13時具有最大反硝化率。降低碳氮比，會使反硝化反應過程不完全，導致水體中硝酸鹽氮的積累[31]。Van等[32]以乙酸為反硝化碳源實驗時發現，當C/N為2∶1或3∶1時，亞硝酸鹽氮完全還原成氣體，而當C/N下降為1∶1時，僅有50%硝酸鹽氮被還原。除此之外，也有研究發現，某些特定的菌株，其C/N的變化范圍較小，在最佳C/N值時能夠誘導菌株釋放足夠的反硝化酶，繼續增加碳源，其反硝化活性不會增加[33]。梁書城[34]通過改變碳源質量濃度調整C/N分別為5、10、15、20，發現在碳源充足的前提下，DL-23菌株的反硝化能力在C/N 10到15之間均表現出了相似的脫氮效果，繼續增加碳源，硝酸鹽氮去除能力并未增強。

3 好氧反硝化反應器處理養殖廢水應用

循環水養殖系統作為近年來流行的養殖方式，其系統內硝酸鹽的積累可達400～500 mg/L[38]，因此許多研究者為去除循環水養殖系統中的硝酸鹽氮而建立好氧反硝化反應器。Kaiser等[39]在封閉循環式魚類養殖虹鱒系統中建立一種轉盤式生物過濾器，通過添加可水解玉米纖維碳源來促進生物濾池內好氧反硝化細菌進行反硝化，運行118 d，硝酸鹽氮由120 mg/L下降至10 mg/L后趨于穩定。Yossi等[40]在金頭鯛(Sparusaurata)循環水養殖系統中利用海藻酸鹽凝膠微球建立移動床反應器(MBB)，以淀粉為碳源處理養殖排放污水，最大硝酸鹽氮脫氮速率可達2.7 mg/(h·L)。

4 固定化好氧反硝化細菌處理水產養殖廢水

許多學者還將好氧反硝化細菌簡單組合構建成微生物制劑，相對于純菌的處理工藝，微生物制劑的混菌降解能力增強。陳進斌等[44]從天津某海水養殖場底泥中分離篩選3株具有高效好氧反硝化特性的微生物，通過正交試驗確定三株菌的最適比例是3∶2∶1，最適比例的菌劑組合在12 h內對海水養殖廢水中硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮的去除率分別為60.45%和67.44%。杜剛等[45]利用PVA和SA固定由光合細菌、放線菌、硝化菌、好氧反硝化菌以及枯草芽孢桿菌組合成的混合菌群用于養殖污水脫氮處理，結果表明氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮的去除率分別為85.0%，87.3%，79.3%。不同功能的微生物固定在同一個載體上，能夠構建成一個微型人工生態系統，菌種之間協同作用進行水產養殖廢水脫氮，具有良好的去除效果。因此，在水產養殖廢水處理中可以將反硝化細菌和硝化細菌按一定比例混合，從而加快脫氮處理效果，實現在同一個反應器中同步硝化反硝化。

5 外加碳源的好氧反硝化處理水產養殖廢水

近年來，許多學者利用新型的可生物降解聚合物作為反硝化碳源和生物膜載體去除養殖廢水中硝酸鹽氮。Boley[48]等利用聚己內酯(PCL)、聚-β-羥丁酸(PHB)和二羧酸二元醇(Bionolle)這3種可生物降解材料作為生物膜載體和反硝化碳源，出水硝酸鹽氮質量濃度穩定在0.1 mg/L以下，而亞硝酸鹽氮質量濃度也可以維持在0.05 mg/L以下，并未出現積累。張蘭河等[49]利用聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)作為固體碳源和生物膜載體，其連接的固相反硝化反應器能顯著降低循環水系統中積累的硝酸鹽，并維持在較低水平(小于10 mg/L)。

6 結論與展望

好氧反硝化作為一種新型的脫氮工藝，具有技術簡單、占地小、能夠實現硝化與反硝化同時進行等優點，被國內外學者廣泛關注。目前越來越多的好氧反硝化細菌被發現，但對于好氧反硝化技術的研究仍停留在試驗階段，雖然有不少學者將好氧反硝化菌應用到反應器中，但實際應用較少。今后的研究重點應該在以下幾個方面：1)篩選分離耐高氨氮、耐高溶氧、耐鹽等特性的好氧反硝化細菌，探究影響好氧反硝化細菌脫氮性能的因素，并結合水產養殖廢水的特點，設計適合水產養殖的反應器和運行模式，為其在海水循環水養殖系統中的應用打下良好的基礎。2)利用分子生物學等技術，深入研究好氧反硝化反應機理，建立好氧反硝化動力學模型，利用基因重組等分子生物學技術強化功能基因，對好氧反硝化細菌種群進行鑒定和跟蹤，提高對水產養殖廢水的脫氮效率。3)生物固定化技術可以提高水產養殖廢水中菌種的密度，防止流速過快、菌種流失，阻礙養殖廢水中的有毒物質對菌株的毒害，故應對固定化微生物技術進行深入研究，并將其應用于水產養殖實踐中，高效、經濟地實現養殖廢水脫氮。

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