印度蔊菜(Rorippa indica)有絲分裂進程觀察與核型分析

涂偉鳳,張 洋,湯 潔,涂玉琴,辛佳佳,姬紅利,張南峰,張 弢

(1.江西省農業科學院,江西 南昌 330200;2.江西省農業科學院 作物研究所,江西 南昌 330200;3.江西省油料作物生物學重點實驗室,江西 南昌 330200;4.江西省中國科學院 廬山植物園,江西 廬山 332900)

蔊菜屬于十字花科蔊菜屬一年生或兩年生植物[1],全草可入藥,具有潤肺、止咳和消炎作用[2],被廣泛用于哮喘、支氣管炎等呼吸道疾病治療,其主要的有效成分為蔊菜素和蔊菜酰胺[3-4]。蔊菜對環境的適應性強,易于栽培管理,與模式植物擬南芥相比,具有發展成為新型模式植物的潛力[5-6]。由于蔊菜具有明顯的抗旱、抗病[7]、耐淹[8-10]、耐貧瘠和結實結籽能力強等優良性狀,其已作為栽培油菜重要的野生近緣物種,用于改良油菜的主要農藝性狀[11-16]。在干旱條件下,甘藍型油菜與蔊菜雜交后代的抗旱性明顯增強[17]。然而,在蔊菜細胞遺傳學方面的研究十分落后,嚴重限制了甘藍型油菜與蔊菜遠緣雜交育種的進程,不能夠深入探討外源遺傳物質對油菜遺傳改良的細胞遺傳學機理以及關鍵功能基因的定位。所以,筆者采用常規壓片和染色體分型技術,進行了蔊菜體細胞有絲分裂進程觀察和中期染色體核型分析研究,以期為蔊菜的染色體組成和行為研究奠定細胞學基礎,為甘藍型油菜的遠緣雜交育種和遺傳改良提供細胞遺傳學理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究用于蔊菜體細胞有絲分裂中期染色體觀察與核型分析的子房壁組織材料,均采自江西省農業科學院蔊菜自然居群內的健康植株(見圖1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 染色體制片 采用幼小雌蕊法[18],在9:00～11:00選取10株長勢良好的蔊菜植株,每株分別采集3簇幼嫩花序,選取幼小花蕾,用尖頭鑷子剝離雌蕊并置于0.2% 8-羥基喹啉溶液中處理3 h。將處理后的雌蕊用純水清洗3遍,然后用吸水紙吸干雌蕊表面的水分,并置于卡諾固定液(乙醇∶乙酸=3∶1)內保存。將經卡諾固定液固定24 h以上的雌蕊用純水清洗3遍,然后置于1 mol/L HCl溶液內，以60 ℃水浴解離10 min；經常規壓片、卡寶品紅染色后觀察染色體有絲分裂進程和中期分裂相細胞的染色體形態結構。

圖1 在自然生長條件下的蔊菜植株

1.2.2 染色體核型分析 選取30張分散良好、染色體形態完整的中期分裂相細胞圖像進行染色體計數,然后利用Photoshop圖像處理軟件進行核型分析。按照李懋學等的標準進行染色體分類和描述,根據染色體的長度比和臂比兩項指標[19]進行核型不對稱程度分類。另外,染色體類型、相對長度和臂比等指標參考Levan等的命名系統[20]。

2 結果與分析

2.1 蔊菜子房壁細胞有絲分裂進程

蔊菜體細胞有絲分裂進程可以分為以下5個階段:間期、前期、中期、后期和末期。間期:間期細胞染色質濃厚,核膜、核仁結構清晰(圖2a)；隨著細胞發育,在核仁周圍形成明顯的亮環區(圖2b)。前期:在細胞核內出現大量絲狀染色體,呈線網狀(圖2c)；此后染色體進一步螺旋化,縮短變粗,核仁消失(圖2d)。中期:極面觀細胞內染色體形態清晰,均勻散布于細胞內,此時期染色體分散比較好的細胞可用于染色體計數和核型分析(圖2e)；側面觀細胞內染色體排列在赤道板上,紡錘體結構明顯,可以清晰地看出多條紡錘絲牽引染色體(圖2f)。后期:所有染色體的著絲粒開始一分為二,兩條染色單體逐漸分離(圖2g)；隨后,兩組染色單體完全分開,并向細胞兩極移動(圖2h)。末期:兩組染色單體移動至細胞兩極(圖2i)；細胞中央出現細胞板和明顯的核仁結構,并逐漸形成兩個子細胞(圖2j)。

2.2 蔊菜子房壁細胞中期分裂相核型

由于蔊菜染色體數量多,體積小,所以染色體壓片難度大,很難獲得染色體分散比較好的中期分裂相細胞。在制片過程中,選取長勢健康旺盛的蔊菜植株,剝離長度在1.5 mm左右的雌蕊可以獲得中期分裂相多、染色體分散較好的細胞(見圖3a)。通過雌蕊子房壁細胞有絲分裂中期染色體計數和形態觀察,可以得出:蔊菜染色體數量為2n=48,即24對染色體(見圖3b)。根據染色體長度的平均值繪制出蔊菜核型模式圖(見圖3c)。

a為蔊菜子房壁細胞有絲分裂染色體中期分裂相; b為核型圖; c為核型模式圖。

根據Levan等的命名系統進行蔊菜染色體形態指標分析，結果詳見表1。從表1可以看出：蔊菜染色體的相對長度范圍為1.51～2.82,屬于小染色體類型植物；臂比范圍在1.04～4.53之間,最長染色體與最短染色體比為1.87,臂比值大于2的染色體比率為0.625；蔊菜核型為2A型,屬于基本對稱型,核型公式為2n=48=12sm+28m+6M+2st。

表1 蔊菜有絲分裂中期染色體核型分析結果

續表1：

染色體序號染色體的相對長度/%長臂短臂全長臂比染色體類型161.100.791.891.38m170.950.871.831.09m181.191.021.811.17m190.910.871.781.04sm200.960.791.761.21m210.940.791.741.19m220.910.871.711.04M230.880.871.671.00M240.710.601.511.19m

3 討論

染色體行為觀察與核型分析是細胞遺傳學研究中十分重要的工作。染色體計數、分類與形態觀察是物種基因組結構解析、起源進化和功能基因定位的必要前提。由于蔊菜具有許多優異性狀,已經被成功應用于近緣栽培物種油菜的遺傳改良。通過蔊菜與油菜遠緣雜交,可以明顯提高油菜的抗旱耐濕能力。但是,蔊菜細胞遺傳學研究的相對落后,嚴重限制了其遠緣雜交后代中外源染色體(片段)鑒定和控制相關農藝性狀的功能基因定位。

本研究通過幼小雌蕊法,詳細地觀察了蔊菜體細胞有絲分裂進程與染色體結構。根據Limade-Faria的標準[21],蔊菜屬于典型的小染色體植物,即所有染色體長度均在1～4 μm范圍內。與十字花科其它屬植物[22-24]相比,蔊菜染色體表現出明顯的數量多、長度小的特點。另外,蔊菜染色體絕對長度均在1.19～2.41 μm范圍內,長度變異相對較小。所以,蔊菜染色體形態結構觀察和精細分類比較困難,在今后的蔊菜細胞遺傳學研究中,需要進一步發展Giemsa染色體分帶技術[25]和染色體熒光原位雜交技術[26],以便快速有效地實現蔊菜染色體結構可視化與精確鑒定。在植物遠緣雜交理論研究中,通過熒光原位雜交技術可以追溯雜交后代的起源、染色體組成以及不同來源染色體間的交換與互作[27-29]。