貴州青錢柳對2型糖尿病大鼠血糖及血脂的影響

陳 旺 張禮行 陳小雪 李 瀟 藍倫禮 廖瑋濤 曾 宇

(廣東藥科大學,廣州,510080)

因進食過多，體力活動減少而導致的肥胖糖尿病發病率逐年升高，且我國糖尿病患者呈年輕化，截止今年其患病人數超過9 000萬，占據全球患病率第1位[1]。其發病因素復雜且具有多方面致病因素，2型糖尿病的基礎病理是由各種原因導致其促進葡萄糖攝取和利用的效率下降，其中以胰島素缺乏和胰島素抵抗不足為主要因素[2-3]。2型糖尿病的致病因素雖未徹底闡明，但目前研究表明其與肥胖及高血脂相關。青錢柳(Cyclocaryapaliurus(Batal)Ijinskaja),是胡桃科屬植物，民間長期用其葉片防治糖尿病，當地居民發現服用青錢柳泡的茶水對2型糖尿病有明顯的療效[4-5]。本實驗通過2型糖尿病大鼠模型，研究青錢柳對2型糖尿病大鼠體重、血糖變化、血糖耐受、脂代謝等指標變化，探討貴州青錢柳對2型糖尿病患者血糖和血脂的影響,為進一步開發青錢柳提供藥效理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取雄性SD大鼠120只，205～225 g，SPF級。由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證證號SYXK(粵)2016-0020。飼養環境：(23±3)℃，濕度(55±15)%，自由飲食飲水，明暗環境各12 h。

1.1.2 藥物 青錢柳樣品，產自貴州省劍河縣，經廣東藥科大學李書淵教授鑒定，為胡桃科青錢柳屬植物青錢柳的嫩葉或芽葉。青錢柳：加水比例為1:10，加熱回流提取3次，1 h/次，凈化，合并濾液，置于水浴鍋上蒸發濃縮至0.6 g/mL作為原液。鏈脲佐菌素(STZ)(美國Sigma公司，批號：S-0130)。

1.1.3 試劑與儀器 二甲雙胍馬來酸羅格列酮片(西班牙Glaxo Wellcome S.A.，注冊證號H20110336)，總膽固醇(TC)試劑盒(國食藥監械(許)字2010第2400057號)、三酰甘油(TG)試劑盒(批號2016061K)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號2016051K)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號2016051K)均購自上海科華生物工程股份有限公司，其他試劑均為分析純。高脂飼料(廣東省醫學實驗動物中心生產)。

SB-1200型旋轉蒸發器(上海愛朗儀器有限公司)；AX10倒置熒光顯微鏡(德國蔡司)；血糖儀Ⅰ型(江蘇魚躍醫療設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取75只造摸成功的大鼠依據隨機數字表分組，共5組，分別為陽性組，模型組，青錢柳高、中、低劑量組，每組15只。選取15只雄性大鼠作為正常對照組。選取100只雄性大鼠高脂高糖膳食4周后空腹12 h，腹腔注射STZ溶液(溶于pH4.5的0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液中)，40 mg/kg，正常對照組腹腔注射pH4.5的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液[6-7]。注射STZ溶液后按照日常補給常規膳食，6 h后補給100 mg/L葡萄糖水,再過6 h撤走葡萄糖水，替換閑置冷凝的水。注射STZ溶液的大鼠高脂高糖膳食1周，待空腹12 h后，剪尾取血并用血糖儀測大鼠空腹血糖，選擇空腹血糖值≥11.1 mmol/L的大鼠為造模成功的2型糖尿病大鼠[8-9]。

1.2.2 給藥方法 正常組按10 mL/kg灌胃純水，并且補給常規膳食，模型組給予腸胃灌水，1次10 mL/kg,同時給予高脂飼料[10]。陽性組按二甲雙胍馬來酸羅格列酮200 mg/kg灌胃水溶液，同時給予高脂飼料。青錢柳水提液高、中、低劑量組分別按6、3、1.5 g/kg灌胃，同時給予高脂飼料[11]。每組大鼠稱重和腸胃灌水，1次/d，并且補給藥物12周。

1.2.3 檢測指標與方法 每日清晨觀察并記錄實驗大鼠的毛色、習性、飲食狀況等日常狀態[12]。使用血糖儀分別檢測給藥后2、4、8、12周空腹血糖值，檢測前大鼠禁食不禁水12 h。連續灌胃給藥12周后，將大鼠禁食不禁水12 h，剪尾取血，采集末次空腹血液，通過血糖儀檢測其血糖值，取數值為0 min的血糖值后，分別給予各組大鼠行腸胃灌注葡萄糖溶液1 g/kg，剪尾取血后再次補給葡萄糖溶液30 min、60 min、120 min后的血液[13-14]，用魚躍準血糖儀分別測定各時間點的血糖值。末次測血糖后，各組大鼠空腹靜待12 h，全身麻醉后行腹主動脈取血，4 800 r/min離心8 min，取上層血清放置EP試管，檢測血清中GSP、TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平[15]。取所有大鼠的胰腺組織和肝臟組織進行包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色、封片等處理，最后鏡檢照相。

2 結果

2.1 貴州青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠體重的影響 模型組大鼠在造模后出現了體重下降，大便糖稀，毛色變暗黃等情況，且模型組體重同正常組比較顯著降低(P<0.05)，即證明造模成功。大鼠體重增長，陽性組和青錢柳樣品低、中、高劑量組與模型組比較，差異無統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 貴州青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠血糖的影響 模型組大鼠血糖明顯高于正常對照組(P<0.05)，與模型組比較，給藥后8周，貴州青錢柳水提液的中劑量組和高劑量組血糖顯著降低(P<0.05)。持續到給藥結束血糖都持續下降并最終穩定在一個較低的值，青錢柳各劑量組與模型組血糖比較，差異有統計學意義(P<0.05)。陽性組從一開始給藥血糖值呈先升后降狀態波動，3個月后降低較多，且陽性組和模型組血糖比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 貴州青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠葡萄糖耐量的影響 糖尿病大鼠在灌服葡萄糖溶液30 min后，青錢柳高、中、低劑量各組中血糖與模型組血糖比較，差異無統計學意義(P>0.05)。灌服葡萄糖溶液60 min后，青錢柳高劑量、中劑量、低劑量各組血糖比模型組血糖略低。灌服葡萄糖溶液120 min后，青錢柳高劑量、中劑量、低劑量各組血糖與模型組血糖比較，低得較為明顯。從開始灌服葡萄糖溶液到120 min這段時間內，模型組血糖持續升高，而青錢柳高、中、低劑量各組血糖及陽性組血糖水平均在30 min左右達到峰值后開始持續下降。見表3。

表1 貴州青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠體重的影響

注:與正常對照組比較，*P<0.05

表2 貴州青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠血糖的影響

注:與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

表3 貴州青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠葡萄糖耐量的影響

注:與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

2.4 貴州青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠糖化血清蛋白(GSP)的影響 模型組和各給藥組大鼠GSP值明顯高于正常對照(P<0.05)。同模型組比較，青錢柳低、中、高劑量組的GSP值明顯降低。此外，青錢柳中劑量組明顯低于模型組(P<0.05)；青錢柳低劑量明顯低于模型組(P<0.05)。見表4。

表4 貴州青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠糖化血清蛋白(GSP)的影響

注:與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

2.5 貴州青錢柳提取液對2型糖尿病大鼠血脂水平的影響 與模型組比較，青錢柳低、中、高劑量組明顯降低大鼠血清的低密度脂蛋白膽固醇水平(P<0.05)；與模型組比較，低劑量青錢柳提取液降低TC水平的效果更佳(P<0.05)。見表5。

2.6 貴州青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠胰腺組織病理學的影響 正常對照組視野下的胰島和外分泌腺之兩者界限清晰，胰島形態完整呈規則狀，數量較多,胰島細胞胞質豐富無空泡化。模型組及給藥各組均有不同程度的胰島細胞萎縮、數量漸少、分布稀疏、胰島細胞退行性萎縮。陽性組胰島細胞數量明顯低于模型組。青錢柳低、中、高3種劑量組相比于模型組胰島萎縮和胰島細胞退行性改變的程度有一定的抑制和改善，胰島形態保持正常。見圖1。

2.7 貴州青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠肝臟組織病理學的影響 正常對照組大鼠肝臟結構完整，細胞核居于細胞中心，肝小葉結構正常，細胞呈放射狀規則排列，其內無多余脂肪滴集群，模型組大鼠肝小葉界限模糊，其細胞索散亂分布，大部分干細胞尤其在小葉中央靜脈局部細胞出現較多的脂肪變性，視野下的胞質出現數量和大小不一的脂滴空泡。陽性組的大鼠肝小葉結構部分變形，其細胞索部分出現散亂和脂肪性病變。與模型組比較，青錢柳低、中、高組能不同程度上改變大鼠肝臟病理病變，特別是青錢柳高劑量組可明顯改善大鼠肝細胞損傷，細胞排列較規則，無過多的脂肪聚集。見圖2。

表5 貴州青錢柳提取液對2型糖尿病大鼠血脂水平的影響

注:與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05

圖1 青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠胰腺組織的影響(HE，×200)

注:A.正常對照組，B.模型組，C.陽性組，D.青錢柳低劑量組，E.青錢柳中劑量組，F.青錢柳高劑量組

圖2 青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠肝形態的影響(HE，×200)

注:A.模型組，B.正常對照組，C.陽性組，D.青錢柳低劑量組，E.青錢柳中劑量組，F.青錢柳高劑量組

3 討論

根據WHO1999標準，2型糖尿病其發病機制主要是胰島素抵抗同時伴有胰島素分泌減少，后期轉為胰島素分泌減少為主且伴有胰島素抵抗，其癥狀表現為血糖過高[15]。患者機體胰島素分泌功能雖然存在，但由于糖尿病的影響導致其作用降低，從而引起胰島素不足以維持患者機體的需求[16]。本研究高脂膳食聯合低劑量STZ處理的模型是目前應用最廣的2型糖尿病模型，既包含高脂飲食這一重要致病因素，又能避免高劑量STZ對胰島B細胞過度損傷，表現為高血糖及胰島素抵抗，較為符合2型糖尿病的發展和特點，造模成功率高。

我們主要研究青錢柳水提液中有效成分對糖尿病合并高血脂模型大鼠血糖、血脂水平的影響，選取大鼠體重、糖耐量、糖化血清蛋白作為血糖檢測指標[17]。貴州青錢柳水提液能增強糖尿病大鼠對葡萄糖的耐受能力，可能是因為青錢柳所含成分能保護胰島B細胞，促使胰島分泌胰島素達到降糖效果。青錢柳各劑量組GSP均比陽性組低，說明青錢柳具有較好控制血糖的功效。總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)是血脂指標。結果顯示青錢柳組的低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油、總膽固醇這3項指標明顯降低，且差異有統計學意義，故可認為青錢柳水提液對2型糖尿病大鼠有降血脂作用。

陽性組胰島細胞數量明顯低于模型組，表明胰島細胞退行性萎縮暫緩[18]。青錢柳低、中、高3種劑量組相比于模型組，對胰島的萎縮和胰島細胞的退行性改變有一定的抑制和改善作用，胰島形態保持正常。說明青錢柳水提液可以改善2型糖尿病大鼠的胰腺損傷[19]。正常對照組大鼠肝臟結構完整，細胞核居于細胞中心，肝小葉結構正常，細胞呈放射狀規則排列，其內無多余脂肪滴集聚，模型組大鼠肝小葉界限模糊，其細胞索散亂分布，大部分干細胞尤其在小葉中央靜脈局部細胞出現較多的脂肪變性，視野下的胞質內出現數量和大小不一的脂滴空泡[20]。陽性組的大鼠肝小葉結構部分變形，其細胞索部分出現散亂和脂肪性病變[21]。與模型組比較，青錢柳低、中、高組能不同程度上改變大鼠肝臟病理病變，特別是青錢柳高劑量組可明顯改善大鼠肝細胞損傷，細胞排列比較規則，無過多的脂肪聚集。青錢柳可降低細胞內脂肪含量促進脂代謝，有一定的保肝作用。

本實驗結果顯示青錢柳可以降低糖尿病合并高血壓大鼠的血糖和血脂水平，改善2型糖尿病大鼠的肝細胞形態，減少肝細胞的脂肪堆積，有一定的胰腺組織保護作用，是具有一定開發潛力和研究價值的天然降糖物質。