穿山龍水提物調控Keap1/Nrf2通路抗CCl4誘導小鼠急性肝損傷作用研究

劉利平 陶旭鋒 韓 旭 許麗娜

(1 大連醫科大學附屬第一醫院，大連，116011； 2 大連醫科大學藥學院，大連，116044)

近年來，肝臟疾病已經成為影響人類健康的最常見疾病之一，尋找有效的防治藥物來應對因各種原因所致的肝損傷，也成為目前研究的熱點。本研究中采用的四氯化碳(Carbon Tetrachloride,CCl4)誘導肝損傷模型是經典的急性肝損傷模型，并廣泛用于保肝藥物的篩選。穿山龍(DioscoreaNipponicaMakino)，別名穿山薯蕷，為多年生纏繞草質藤本，其根莖是一種重要的中藥材，具有舒筋活絡、止咳化痰、祛風止痛等功效。本研究的目是評價穿山龍水提物對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用及其分子機制，為該天然產物的深入研究和開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 昆明小鼠，體重(18～22)g，雄性，由大連醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(遼)2013-0003。

1.1.2 藥物 穿山龍藥材(購于云南千草源藥業有限公司)；水飛薊素和羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(購于Sigma公司)。

1.1.3 試劑與儀器 DAPI、Tris、SDS(購于Sigma公司)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(均購于南京建成生物工程研究所)；谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1(Keap1)、醌氧化還原酶-1(NQO1)、核因子E2相關因子2(Nrf2)、SOD1、SOD2、血紅蛋白加氧酶-1(HO-1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗及二抗(均購于武漢三鷹生物技術有限公司)；iNOS引物[購于英濰捷基(上海)貿易有限公司]。

AL104電子天平(METTLER TOLEDO，上海)；98-1-B型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；R-501旋轉蒸發儀(上海科升儀器有限公司)；U-3010紫外可見分光光度計(HITACHI,日本)；DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；美國UVP凝膠成像系統(BioSpectrum系列，美國)；7500實時定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 小鼠隨機分為對照組(Control)、模型組(Model)、AEDN低劑量組、中劑量組、高劑量組和水飛薊素陽性對照組，每組10只。小鼠第7天灌胃2 h后，對照組腹腔注射橄欖油，其余各組腹腔注射0.35% CCl4橄欖油溶液建立急性肝損傷模型。

1.2.2 藥物提取方法 取穿山龍藥材500 g，加入4 000 mL的水，于電熱套中加熱回流提取。大火煮沸，轉小火煮約2 h，藥液趁熱過濾，濾液備用。以上實驗過程重復4次，共制得濾液約15 000 mL。濾液用旋轉蒸發儀反復蒸掉水分后，加入約4 200 mL 95%乙醇溶液，混勻，靜置24 h。沉淀進一步旋蒸、濃縮后，于真空干燥器中干燥數天成粉末，即為穿山龍水提物(AEDN)，用小型粉碎機磨成粉末狀備用。

1.2.3 多糖含量測量方法 采用紫外-可見分光光度法對AEDN中多糖的含量進行測定。首先配制梯度濃度10～200 μg/mL的葡萄糖溶液作為標準品，加入20%苯酚溶液和4 mL濃硫酸顯色，以空白試劑作參比，在490 nm處測A值，以吸光度A對葡萄糖標準品濃度C進行線性回歸。配制濃度為150 μg/mL的AEDN樣品，同法重復測定3次其吸光度值，標準曲線法計算穿山龍多糖含量。

1.2.4 給藥方法 稱取適量的AEDN和水飛薊素，溶于0.5% CMC-Na溶液，研磨均勻后用于小鼠灌胃給藥。對照組和模型組小鼠灌胃給予0.5% CMC-Na溶液，AEDN低、中、高劑量組小鼠按50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg灌胃給予AEDN，水飛薊素陽性對照組按250 mg/kg灌胃給予水飛薊素，連續灌胃給藥7 d，實驗期間各組小鼠正常進食、進水。

1.2.5 檢測指標與方法 1)小鼠造模24 h后處死，解剖取肝臟。分別稱取各小鼠的肝組織100 mg加入0.9%NaCl溶液勻漿，10 000 r/min離心10 min，取上清液4 ℃冷藏備用。按照試劑盒操作說明書，肝組織勻漿上清液測定其MDA、SOD、GSH和GSH-Px的水平，余下肝組織保存于-80 ℃冰箱。2)采用Western blot法測定各組小鼠肝組織中Keap1、Nrf2、SOD1、SOD2、GST、HO-1和NQO1蛋白的表達。稱取于-80 ℃保存的肝組織100 mg，于裝有1 mL預冷的RIPA裂解液的EP管中，用組織勻漿機制備肝組織勻漿。待肝組織充分裂解后，10 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液即為肝組織總蛋白。以BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定各樣本中的蛋白濃度。組織總蛋白稀釋至10 μg/μL，與2×loading buffer(100 μl+4 μl β-巰基乙醇)按體積比1∶1混勻，煮沸5 min變性。取50 μg變性后的總蛋白上樣，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在120V恒壓下電泳，直至溴酚藍到達膠底部，停止電泳。按濕法轉膜將PVDF膜在甲醇中浸泡10 s后，將其和濾紙、凝膠一同放入轉移緩沖液中浸泡后一起放入轉膜器，冰水浴中，300 mA恒流轉膜2～3 h。將載有目標蛋白質的PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，搖床上室溫封閉3 h。將PVDF膜放入目的蛋白相應的一抗中，4 ℃孵育過夜。取出膜后，以TTBS洗膜3次，10 min/次，再將膜放入二抗中，室溫下搖床孵育2 h，TTBS洗膜3次，10 min/次。ECL試劑盒顯色，采用動態積分模式進行拍照并用Gel-Pro 4.0軟件對蛋白條帶進行灰度分析。以GAPDH為內參蛋白，計算Keap1、Nrf2、SOD1、SOD2、GST、HO-1和NQO1的相對表達量。3)采用Real-time PCR法測定各組小鼠肝組織中iNOS mRNA的水平。稱取肝組織100 mg，按試劑盒規定方法提取總RNA，以分光光度法測定其濃度后，將總RNA溶液稀釋成0.5 μg/μL后按照試劑盒說明書進行逆轉錄，獲得的cDNA保存于-20 ℃冰箱。引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司設計和合成，序列見表1。按照試劑盒操作說明進行Real-time PCR反應。以GAPDH基因作為管家基因，用2-△△Ct法分析肝組織iNOS基因的相對表達。

表1 小鼠相關引物序列

2 結果

2.1 穿山龍水提物的提取率及多糖含量的測定 本實驗采用水提取醇沉淀的方法，2 000 g的穿山龍藥材共制得192.83 g穿山龍水提物，提取率為19.64%。紫外可見分光光度法測定AEDN中多糖的含量為(53.03±0.70)%。

2.2 AEDN對CCl4誘導肝損傷小鼠肝組織氧化應激指標的影響 本研究測定了AEDN對CCl4誘導小鼠急性肝損傷肝組織中MDA、SOD、GSH和GSH-Px含量的影響，結果如圖1所示。小鼠接受CCl4干預后，肝組織損傷導致其中MDA含量顯著上升，SOD、GSH和GSH-Px的含量顯著下降。給予AEDN(200 mg/kg)后，肝組織中MDA的含量降低(0.70±0.08 nmol/mg protein)，差異有統計學意義(P<0.01)；SOD、GSH和GSH-Px的含量升高，分別升高至(21.15±2.16)U/mg protein、(8.53±1.04)mg/g protein和(73.34±12.21)U，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 AEDN對CCl4作用下的小鼠肝組織生化指標的影響

注:與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01

圖2 AEDN對CCl4誘導肝損傷小鼠Keap1和Nrf2蛋白表達的影響

注:與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01

圖3 AEDN對CCl4誘導下肝損傷小鼠氧化應激信號通路蛋白表達的影響

注:與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01

2.3 AEDN對CCl4誘導小鼠肝損傷Keap1/Nrf2信號通路蛋白的影響 本研究采用Western blot法測定了AEDN對小鼠肝損傷氧化應激信號通路蛋白的影響。如圖2所示，模型組中的Keap1蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.01)、Nrf2蛋白表達下降，差異有統計學意義(P<0.01)，給予AEDN(200 mg/kg)后，Keap1蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)，Nrf2蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。同時，AEDN能夠顯著上調SOD1、SOD2、GST和NQO1蛋白的表達水平，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖4 AEDN對CCl4誘導肝損傷小鼠肝組織iNOS水平的影響

注:與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01

2.4 AEDN對CCl4誘導小鼠肝損傷iNOS的影響 本研究采用了Real-time PCR法測定肝組織iNOS的水平，結果如圖4所示，與對照組比較，模型組中iNOS水平顯著上調，AEDN 3個劑量均能顯著降低肝組織中iNOS mRNA的表達水平，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖5 苯酚-硫酸顯色法的紫外-可見光掃描光譜圖

注:A葡萄糖對照品，B穿山龍水提物

3 討論

AEDN中含有多糖、水、蛋白質和各種鹽類等，但因本研究采用了水提醇沉法進行了初步除雜，因此水提物中的主要成分為多糖。圖5是葡萄糖對照品和AEDN樣品經苯酚-硫酸顯色法顯色后，進行紫外-可見光掃描的光譜圖。由圖可以看出，AEDN的紫外掃描圖與葡萄糖標準品相似，且最大吸收波長均在490 nm處。因此，AEDN經苯酚-硫酸法顯色后，以490 nm作為檢測波長。

近年來隨著對CC14誘導的急性肝損傷的分子作用機制不斷深入和廣泛的研究，發現氧化應激是藥物對其發揮保肝作用主要分子機制之一[1]。MDA是脂質過氧化的終末降解產物，可與胞質、膜蛋白或某些酶結合成聚合體，損害細胞膜結構，引起肝細胞變性、壞死[2]。急性肝損傷時，肝組織缺血缺氧，脂質過氧化作用增強，MDA水平升高[3]。SOD是由金屬輔酶和蛋白質構成的金屬酶，SOD1是SOD的最主要亞型，具有抗氧化、抗炎、抗衰老和維護基因組DNA的穩定等功能，同時通過其催化產物H2O2參與調節細胞的生長代謝[4]。SOD2易受促炎性因子、輻射、氧化應激等因素的誘導，繼而大量表達，維持線粒體內氧自由基的動態平衡，減輕氧化應激損傷[5]。SOD能特異地與超氧化物陰離子(O-2)發生歧化反應，清除O-2，保護機體不受自由基損害。GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，特異地催化GSH對過氧化物的還原反應，能清除過氧化物代謝產物，阻斷脂質過氧化鏈鎖反應，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用。本研究中AEDN降低了肝組織中MDA水平、升高肝組織中SOD、GSH和GSH-Px含量，緩解了急性肝損傷時的氧化應激反應。

為進一步探討AEDN抗急性肝損傷作用，我們對其作用的分子機制進行了深入研究。在對氧化應激過程中，Keap1/Nrf2是一條重要的調控通路。Keap1是Kelch家族中的一種阻逷蛋白，正常狀態下存在于胞質的肌動蛋白細胞骨架上，是Nrf2的負性調節蛋白[6]。Nrf2屬于Cap-n-Collar(CNC)調節蛋白家族，是細胞抗氧化應激中的關鍵轉錄因子，在生理狀態下與胞質中的Keap1結合處于非活性狀態。當機體受到其他親核試劑刺激或處于氧化應激狀態時，Nrf2與Keap1解離，Nrf2磷酸化后轉入細胞核與抗氧化反應元件(ARE)結合，啟動ARE調控的下游Ⅱ相代謝酶及抗氧化蛋白基因的表達，提高機體的抗氧化應激能力[7]。本研究發現AEDN能顯著下調肝損傷后肝組織Keap1的蛋白表達，上調Nrf2的蛋白表達。

HO-1、NQO1、GST等是Nrf2下游調控的重要靶蛋白，肝損傷時NQO1、HO-1的表達降低，與Nrf2呈正相關性[8-10]。GST為一種不含硒的GSH-Px，是體內最重要的Ⅱ相代謝酶之一，可保護DNA和蛋白質免受損害，達到解毒目的。GST在肝小葉中分布均勻，且分子量較小，在肝損傷后能快速、特異性的反應肝細胞的損傷狀態[11]。血紅蛋白加氧酶(HO)是血紅蛋白分解代謝的限速酶，HO-1是HO的氧應激誘導型，在急性肝損傷中可被誘導大量表達，一方面通過血紅蛋白的3種酶解產物，清除自由基，抗氧化；另一方面，減輕脂質過氧化，降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)活性和TNF-α水平，抗細胞凋亡、抗炎，發揮保肝護肝作用[12]。在CC14誘導的急性肝損傷中，HO-1 mRNA的表達下調[13]。NQO1是一種黃素蛋白酶，能以NAD(P)H為電子供體，還原醌類及其衍生物，并使其毒性降低，保護機體的氧化應激損傷，作為Ⅱ相代謝酶之一，在機體的解毒代謝中發揮重要作用[14]。本研究發現AEDN能上調肝損傷后肝組織中SOD1、SOD2、HO-1、NQO1、GST蛋白的表達。

iNOS為一氧化氮合酶(NOS)的誘導型，是產生NO的限速酶。生理狀態下NO有一定的保護肝臟的作用，病理狀態下，激活后的iNOS產生大量的NO，高濃度NO可引起肝臟損傷，其機制一方面與NO自身的細胞毒性有關，另一方面與NO激活中性粒細胞的粘附作用和氧化應激等有關[15-16]。AEDN顯著下調肝損傷所致iNOS mRNA水平的異常增高，緩解氧化應激。

本研究發現AEDN能夠顯著下調肝組織中MDA水平、iNOS mRNA表達水平和Keap1的蛋白表達，顯著上調GSH、GSH-Px、SOD、SOD1、SOD2、HO-1、NQO1、GST和Nrf2的蛋白表達水平。以上結果表明AEDN具有較好的抗CCl4誘導的急性肝損傷作用，這種作用可能是通過調控Keap1/Nrf2信號通路降低氧化應激損傷作用實現的。