丹參酚酸B調節缺氧損傷乳鼠心肌細胞TLR4-NFκB-TNFα炎性反應通路的量效時效關系研究

張 云 張 婷 郭麗麗 劉瑞華 吳廣均 張盈穎

(1 中國中醫科學院廣安門醫院免疫研究室,北京,100053; 2 中國中醫科學院廣安門醫院藥劑科,北京,100053; 3 中國中醫科學院廣安門醫院新藥研發中心,北京,100053)

Toll樣受體4(TLR4)是一種跨膜信號轉導受體,在免疫細胞、內皮細胞、心肌細胞、肝細胞和神經膠質細胞等表面廣泛存在表達[1-2]。TLR4主要通過核轉錄因子(NFκB)誘導炎性反應遞質和炎性反應因子的產生釋放激活炎性反應的發生[3-4]。研究發現阿托伐他汀通過抑制TLR4和NFκB信號通路改善結腸炎大鼠的腸道炎性反應[5]。魚腥草素鈉顯著抑制LPS刺激的牛乳腺上皮細胞TLR4的表達和NF-κB的激活,且抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的產生[6]。我們前期的實驗研究也發現,丹參酚酸B能顯著抑制TLR4-NF-κB-TNF-α炎性反應通路,從而保護缺氧損傷和炎性反應損傷心肌細胞[7-8]。本文在前期工作基礎上進一步深入研究SalB保護缺氧損傷心肌細胞的量效和時效關系。闡明SalB治療缺血性疾病的作用機制并為臨床合理用藥提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 出生1～3 d Sprague-Dawley乳鼠購自北京維通利華實驗動物中心,經中國中醫科學院廣安門醫院倫理委員會批準用于實驗研究。頸動脈放血處死后,立即用75%乙醇消毒皮膚開胸摘取心臟,留取心尖至心室部分,D-HANKS液清洗后剪成1 mm3小塊,每只心臟加入2 mL混合消化液進行多次消化,收集乳鼠心肌細胞。詳細方法參照文獻[7-8]。

1.1.2 藥物 丹參酚酸B對照品(Salvianolic acid B):購自四川先欣生化技術研究所,面積歸一化法檢測純度為98.90%,貨號XXB-SMI-004。

1.1.3 試劑與儀器 低糖DMEM培養基:美國Hyclone產品,貨號SH3002101B;D-HANKS:TBD Science產品,貨號HA2004Y;Ⅱ型膠原酶:Sigma公司產品,100 mg/支,貨號C6885;0.25%胰酶:美國Hyclone產品,貨號SH3004201;TLR4和NFκB引物(賽百盛生物技術公司合成);Trizol 100 mL(Invitrogen,Cat No.15596-026,USA);SYBR green PCR master Mix(ABI,Cat No.4309155,UK);反轉錄試劑盒(MBI,Cat No.K1622,USA);兔抗大鼠TLR4和NFκB多克隆抗體(Santa Cruz,貨號分別是:sc-30002和sc-33022);TNFα ELISA檢測試劑盒:美國RB公司產品,貨號3R080。SANYO CO2培養箱;OLLYMPUS IX-70型倒置顯微鏡;超凈工作臺;MULTISKAN MK3全自動多功能酶標儀(Thermo,USA)及缺氧培養裝置。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 心肌細胞共分為5組,分別為:正常組;缺氧模型組;SalB大劑量組;SalB中劑量組;SalB小劑量組。采用缺氧裝置系統,將細胞置于充滿95%N2密封裝置內,采用無糖D-Hanks液代替DMEM培養基。血氣分析表明常氧和缺氧細胞培養液中氧分壓分別為200 mmHg和21 mmHg,達到所需要的缺氧條件。

1.2.2 給藥方法(或干預方法) SalB大、中、低劑量濃度分別為10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L。預防給藥是指SalB加入培養基后6 h再置于缺氧裝置6 h后收集標本;同時給藥是指SalB加入培養基后立即置于缺氧裝置6 h后收集標本;后給藥是指細胞置于缺氧裝置6 h后加入SalB干預6 h再收集標本。

1.2.3 檢測指標與方法 qRT-PCR檢測方法:沖洗刮取并離心收集心肌細胞,加入0.5 mL Trizol混合,按Trizol說明抽提總RNA。總RNA的反轉錄、引物設計和RT-PCR的擴增條件都與前期的實驗研究一致,具體內容參見文獻[9]。免疫組化及ELISA法:免疫組化法檢測爬片細胞TLR4和NFκB蛋白,ELISA法檢測培養上清液中TNFα濃度,均嚴格按照說明書操作。

2 結果

2.1 丹參酚酸B調節缺氧心肌細胞TLR4 mRNA的量效和時效作用 與正常組比較,缺氧各組心肌細胞TLR4 mRNA表達顯著升高(P<0.01或P<0.05)。與缺氧組比較,丹參酚酸B預防給藥大、中、小劑量組TLR4 mRNA表達均顯著下降(P<0.01或P<0.05)。丹參酚酸B同時給藥大、中劑量組TLR4 mRNA表達顯著下降(P<0.05)。丹參酚酸B后給藥各組TLR4 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 SalB不同給藥濃度和時間對心肌細胞TLR4 mRNA表達量的調節

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與缺氧組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.2 丹參酚酸B調節缺氧心肌細胞NFκB mRNA表達的量效和時效作用 與正常組比較,缺氧各組心肌細胞NFκB mRNA表達顯著升高(P<0.01或P<0.05)。與缺氧組比較,丹參酚酸B預防給藥大、中、小劑量組NFκB mRNA表達均顯著下降(P<0.01或P<0.05)。丹參酚酸B同時給藥大、中劑量組NFκB mRNA表達顯著下降(P<0.05)。丹參酚酸B后給藥各組NFκB mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖1。

表2 SalB不同給藥濃度和時間對心肌細胞NFκB mRNA表達量的調節

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與缺氧組比較,△P<0.05,△△P<0.01

圖1 RT-PCR法檢測TLR4和NFκB mRNA溶解曲線和擴增曲線圖

注:a為β-actin溶解曲線,b為TLR4溶解曲線,c為NFκB溶解曲線,d為β-actin擴增曲線,e為TLR4擴增曲線,f為NFκB擴增曲線

2.3 丹參酚酸B調節缺氧心肌細胞TLR4蛋白表達的量效和時效作用 與正常組比較,缺氧各組心肌細胞TLR4蛋白表達面積均顯著升高P<0.01)。和缺氧組比較,丹參酚酸B預防給藥大、中、小劑量組TLR4蛋白的表達面積均顯著下降(P<0.01或P<0.05)。丹參酚酸B同時給藥大、中劑量組TLR4蛋白的表達面積顯著下降(P<0.05)。丹參酚酸B后給藥各組TLR4 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表3,圖2。

表3 SalB不同給藥濃度和時間對心肌細胞TLR4蛋白表達量的調節(μm2)

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與缺氧組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.4 丹參酚酸B調節缺氧心肌細胞NFκB蛋白表達的量效和時效作用 與正常組比較,缺氧各組心肌細胞NFκB蛋白表達面積均顯著升高(P<0.01)。和缺氧組比較,丹參酚酸B預防給藥大、中、小劑量組NFκB蛋白的表達面積均顯著下降(P<0.01或P<0.05)。丹參酚酸B同時給藥大、中劑量組NFκB蛋白的表達面積均顯著下降(P<0.05)。丹參酚酸B后給藥各組NFκB mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 SalB不同給藥濃度和時間對心肌細胞NFκB蛋白表達量的調節(μm2)

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與缺氧組比較,△P<0.05,△△P<0.01

2.5 丹參酚酸B調節缺氧心肌細胞TNFα表達的量效和時效作用 與正常組比較,缺氧各組細胞上清液中TNFα含量均顯著升高(P<0.01)。和缺氧組比較,丹參酚酸B預防給藥大、中、小劑量組TNFα含量均顯著下降(P<0.01或P<0.05)。丹參酚酸B同時給藥大、中劑量組TNFα含量均顯著下降(P<0.05)。丹參酚酸B后給藥各組TNFα含量差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 SalB不同給藥濃度和時間對心肌細胞TNFα表達量的調節(nmol/mL)

注:與正常組比較,*P<0.05,**P<0.01;與缺氧組比較,△P<0.05,△△P<0.01

圖2 SalB缺氧前6 h預防給藥各組心肌細胞培養狀態及細胞爬片TLR4免疫組化染色圖

注:a為正常組,b為模型組,c為SalB大劑量組,d為SalB中劑量組,e為SalB小劑量組。a1、b1、c1、d1、e1為各組對應的細胞爬片TLR4免疫組化染色圖。可見正常組細胞形態完整,無著色;模型組細胞固縮壞死,著色深;SalB大、中、小劑量組較模型組細胞形態相對完整,著色明顯變淺

3 討論

缺氧損傷是某些缺血性疾病的主要病理損傷因素,且伴隨疾病的發生、發展和轉歸的全過程。如重要臟器心腦腎的缺血性疾病:冠心病、急性心肌梗死、腦梗死、腎動脈狹窄和腎動脈硬化等。缺氧誘導腎上皮細胞TLR4和NF-κB的表達,引起細胞凋亡、炎性反應因子TNF-α釋放和腎小管間質纖維化。糖蛋白Slit2可以抑制TLR4和NF-κB的表達減輕炎性反應和纖維化的發生[10]。缺氧的脂肪細胞TLR4受體表達上調8.8倍、NF-κB信號激活、炎性反應因子釋放。本研究發現缺氧損傷乳鼠心肌細胞在缺氧后6 h TLR4和NF-κB mRNA和蛋白的表達均顯著增加,細胞上清液中TNF-α含量也顯著升高[11]。據此,我們推斷缺氧狀態下TLR4-NF-κB-TNF-α炎性反應通路明顯激活,是缺氧狀態下炎性反應損傷的主要機制。

活血化瘀中藥丹參被廣泛應用于心腦血管疾病和糖尿病腎病等動脈粥樣硬化的預防和治療[12-13]。丹參酚酸B是丹參中含量最豐富的生物活性化合物。SalB可呈劑量依賴性地降低缺血再灌注引起的神經功能損傷,治療局灶性腦缺血再灌注損傷[14]。SalB還能增加缺血缺氧干細胞的存活率[15]。SalB對腦缺血再灌注的保護作用與抑制血小板活化和下調NF-κB通路相關。我們課題組前期的研究工作發現,SalB能保護缺氧損傷和炎性反應損傷心肌細胞,其作用機制與抑制TLR4-NF-κB-TNF-α炎性反應通路相關[7-8]。但目前未見關于SalB對缺氧損傷心肌細胞保護作用的量效和時效關系研究報導。

本研究發現SalB對缺氧損傷乳鼠心肌細胞TLR4-NF-κB-TNF-α炎性反應通路的抑制作用存在明顯的量效和時效關系。大、中劑量組較小劑量組效果顯著。缺氧前預防給藥和缺氧同時給藥較缺氧后給藥效果顯著。因此,我們認為臨床應用丹參酚酸B或丹參類制劑(如丹紅注射液,丹七片、丹參滴丸等)治療缺血性疾病宜早期、足量和全程給藥為佳,以便更好地發揮其抗炎和保護缺氧損傷組織細胞的作用。

本研究是細胞實驗,干擾混雜因素少,實驗結果具有可靠性。今后還需要進一步進行動物實驗和臨床實驗研究,需要考慮到病和證的對應和結合,丹參主要對應的是血瘀證。