丹參酮ⅡA對(duì)大鼠急性脊髓損傷SOCS3/STAT3信號(hào)通路的影響

聶 宇 周納新 劉 健 萬(wàn) 峰 傅德皓

(1 湖北省宜昌市中心人民醫(yī)院骨科，宜昌，443000； 2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院，武漢，430022)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是一種以損傷平面以下感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能完全喪失和大小便失禁為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重創(chuàng)傷[1]。目前沒(méi)有有效的治療手段能恢復(fù)SCI的神經(jīng)功能。細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子(Suppressors of Cytokine Signaling，SOCS)家族是一類對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)通路具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用的蛋白分子，參與多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和激素的信號(hào)調(diào)節(jié)[2]。近年來(lái)細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3(Suppressors of Cyto-kine Signaling-3，SOCS3)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3(Signal Transducer and Activator of Transcription-3,STAT3)信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用倍受關(guān)注。一般認(rèn)為，該途徑廣泛參與神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化及衰老等過(guò)程，并與腦腫瘤、缺血損傷等神經(jīng)系統(tǒng)病理過(guò)程密切相關(guān)[3]。丹參酮ⅡA是從丹參中提取的脂溶性有效成分之一，對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)已成為研究熱點(diǎn)[4]。為探討丹參酮ⅡA對(duì)大鼠急性脊髓損傷炎性反應(yīng)的影響，建立大鼠急性脊髓損傷模型，采用丹參酮ⅡA對(duì)大鼠進(jìn)行干預(yù)，研究其對(duì)SOCS3/STAT3信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SD大鼠60只，雌雄不限，體重220～250 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物房溫度18～25 ℃，濕度50%～75%，12 h交替光照，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，每日觀察動(dòng)物進(jìn)食情況，稱體重，及時(shí)清理糞便。本研究中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 藥物 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液粉(杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司，10 mg/瓶，國(guó)藥準(zhǔn)字GR0532)。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠細(xì)胞SOCS3 ELISA試劑盒(上海研盟生物科技有限公司，產(chǎn)品貨號(hào)：YMR30908)，大鼠細(xì)胞STAT3 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，產(chǎn)品貨號(hào)：E-EL-R1226c)，提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，Viking神經(jīng)電生理儀(美國(guó)尼高利公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將SD大鼠60只按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為脊髓損傷組(對(duì)照組)、脊髓損傷/丹參酮IIA治療組(觀察組)2組，每組各30只。每組按時(shí)相分為5小組(n=6)。后正中切口，將T8-10椎板全部切除，顯露硬脊膜并保持其完整性。在硬膜表面放置一曲度相似的直徑為3.0 mm的圓形銅制墊片，用5 g的銅制重物在玻璃試管的引導(dǎo)下從8 cm處垂直自由落下，打擊墊片，致傷脊髓[5]。致傷沖量為40 gcf，造成中度脊髓損傷。術(shù)后見(jiàn)大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮撲動(dòng)，雙下肢癱瘓表明撞擊成功。生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合傷口。術(shù)后青霉素5萬(wàn)U/只/d，注射3 d。損傷后每天10:00、17:00點(diǎn)2次人工膀胱排尿,直至建立反射性膀胱排空。各組大鼠在脊髓損傷后8 h、1 d、3 d、7 d、14 d取材，每組取6只。大鼠俯臥位置于特制臺(tái)上，背部剪毛，無(wú)菌操作，腰椎取背部正中切口，切除L2-L4雙側(cè)椎板，充分顯露L3-L4節(jié)段硬脊膜，背部正中腰椎部分切開(kāi)，鈍性剝離腰椎周圍的肌肉，剪下腰椎，用咬骨鉗輕輕咬掉脊髓周圍的骨組織，快速取下脊髓組織，液氮保存。PBS液清洗，放入液氮罐中，備用。

1.2.2 給藥方法 脊髓損傷后30 min內(nèi)，觀察組大鼠經(jīng)腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，給藥劑量計(jì)算方法：人的給藥劑量×人的轉(zhuǎn)換因子(36.8)/大鼠的轉(zhuǎn)換因子(6.9)=人的給藥劑量×5.3478。對(duì)照組注入等量生理鹽水。連續(xù)給藥10 d。

1.2.3 觀察指標(biāo) HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察；采用Viking神經(jīng)電生理儀,行MEP檢測(cè)；用RT-PCR半定量分析脊髓組織中SOCS3mRNA、STAT3mRNA的表達(dá)；TUNEL法行神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠大致觀察 術(shù)后所有動(dòng)物均存活,飲食活動(dòng)正常,未見(jiàn)手術(shù)部位破潰、紅腫等不良反應(yīng)。

2.2 2組大鼠組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 損傷后1 d損傷對(duì)照組脊髓灰質(zhì)部有廣泛灶性出血，大量紅細(xì)胞滲出,神經(jīng)元核濃縮，染色增強(qiáng)，隨時(shí)間推移逐漸出現(xiàn)神經(jīng)元固縮、壞死、溶解，細(xì)胞體積變小,有大量小膠質(zhì)細(xì)胞增生和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；白質(zhì)中也見(jiàn)較多紅細(xì)胞滲出，髓鞘腫脹和大量空泡,周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠質(zhì)細(xì)胞增生。觀察組損傷部位脊髓灰質(zhì)部腫脹變形、出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較對(duì)照組輕,白質(zhì)點(diǎn)狀出血，白質(zhì)中有較多的正常軸突。

2.3 2組大鼠電生理學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較 記錄術(shù)后各時(shí)點(diǎn)MEP波幅、潛伏期與術(shù)前比較所占的百分比，MEP波幅(%)=術(shù)后MEP波幅/術(shù)前MEP波幅×100% MEP潛伏期(%)=術(shù)后MEP潛伏期/術(shù)前MEP潛伏期×100%。1)觀察組在術(shù)后8 h、1 d、3 d、7 d、14 d時(shí)點(diǎn)MEP波幅(%)較對(duì)照組明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。術(shù)后14 d，對(duì)照組MEP波幅為(77.00±5.16)%，觀察組為(89.27±6.02)%。2)觀察組和對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)MEP潛伏期(%)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著時(shí)間的推移2組MEP潛伏期均逐漸趨向正常，術(shù)后14 d，對(duì)照組MEP潛伏期為(101.05±1.18)%，觀察組為(100.33±1.25)%。見(jiàn)圖1、圖2。

2.4 2組大鼠SOCS3mRNA、STAT3mRNA的表達(dá)比較 對(duì)照組、觀察組SOCS3mRNA表達(dá)均增高，STAT3 mRNA表達(dá)均下降。但觀察組SOCS3mRNA表達(dá)明顯增高、STAT3mRNA表達(dá)明顯下降，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示丹參酮ⅡA具有促進(jìn)SOCS3mRNA表達(dá)，抑制STAT3mRNA表達(dá)的作用。見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠脊髓損傷不同時(shí)點(diǎn)的SOCS3mRNA、STAT3mRNA表達(dá)比較

注:與對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

表2 2組大鼠脊髓損傷不同時(shí)點(diǎn)的凋亡細(xì)胞數(shù)比較

注:與對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖1 脊髓損傷后MEP波幅%的時(shí)程變化(橫軸：時(shí)間；縱軸：MEP波幅%)

圖2 脊髓損傷后MEP潛伏期%的時(shí)程變化(橫軸：時(shí)間；縱軸：MEP潛伏期%)

2.5 TUNEL法神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 2組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞可見(jiàn)具有典型的凋亡特征性的改變，染色質(zhì)固縮，呈斑塊狀聚集于核膜周邊，胞質(zhì)濃染。對(duì)照組術(shù)后8 h開(kāi)始有少量陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)，1 d后逐漸增高，3 d增多顯著，7 d到達(dá)高峰，高峰時(shí)主要發(fā)生在白質(zhì)中膠質(zhì)細(xì)胞，以后呈下降趨勢(shì)。而觀察組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目明顯少于損傷對(duì)照組，3 d達(dá)到高峰，3～7 d維持在較高的水平，然后逐漸回落各時(shí)點(diǎn)凋亡指數(shù)分別進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表2。

3 討論

丹參中主要包括水溶性酚酸類、脂溶性丹參酮類等有效成分[6]。丹參酮是中藥丹參根的乙醚提取物中的成分，為丹參主要有效成分，經(jīng)過(guò)大量藥理、毒理、有效成分及臨床研究證明，該藥對(duì)多種疾病尤其是有確切的療效，且毒性較小[7-8]。丹參酮ⅡA為丹參酮中主要有效成分之一,為脂溶性櫻紅色針狀結(jié)晶，可參與機(jī)體的多種生化反應(yīng)而有多種生物活性。具有抗炎、抑制細(xì)胞凋亡、降低氧自由基等作用，用于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及缺血性腦血管病的治療取得了較好療效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究亦證實(shí)丹參酮丹參酮注射液可能通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，減少低氧誘導(dǎo)因子1-α的表達(dá)，改善脊髓缺血再灌注損傷組織局部缺氧環(huán)境，對(duì)減輕脊髓缺血再灌注損傷起到積極的防治作用[9]。

原發(fā)性脊髓損傷是指創(chuàng)傷本身造成的灰質(zhì)和白質(zhì)受損，神經(jīng)通路中斷；繼發(fā)性脊髓損傷是指創(chuàng)傷引起了局部一系列生化改變，使組織缺血、缺氧，膜脂質(zhì)過(guò)氧化，最終導(dǎo)致脊髓細(xì)胞死亡、退變、上行下行纖維傳導(dǎo)中斷[10]。凋亡以延遲的形式出現(xiàn)，研究證實(shí)，凋亡在SCI后繼發(fā)性損傷中扮演重要的角色，特別是大量白質(zhì)損傷致神經(jīng)缺失[11]。TUNEL陽(yáng)性神經(jīng)元在原發(fā)性損傷后4～24 h觀測(cè)到，在傷后7 d出現(xiàn)繼發(fā)性少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡[12]。因?yàn)樯偻荒z質(zhì)細(xì)胞對(duì)髓鞘形成和保護(hù)這些長(zhǎng)的透射纖維非常重要，SCI后少突膠質(zhì)細(xì)胞的丟失，導(dǎo)致余下神經(jīng)纖維束的變形，從而引起脊髓損傷平面以下的運(yùn)動(dòng)失控和感覺(jué)缺失。在本實(shí)驗(yàn)中，丹參酮ⅡA觀察組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯比損傷對(duì)照組低。電生理檢測(cè)表明，MEP在觀察組較對(duì)照組有明顯恢復(fù)，這說(shuō)明脊髓前部的運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)通路經(jīng)過(guò)治療后有所恢復(fù)，通過(guò)丹參酮ⅡA治療可以顯著降低急性脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，減輕SCI所致的神經(jīng)功能的缺失。

SOCS3/STAT3信號(hào)通路主要作用機(jī)制是通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子途徑(Janus Kinase/signal Transducer and Activator of Transcription，JAK/STAT)途徑的負(fù)性調(diào)控而發(fā)揮作用[13]。這種負(fù)反饋?zhàn)饔弥饕ㄟ^(guò)以下3種途徑完成:1)利用和STAT相似的SH2結(jié)構(gòu)域,競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞因子受體胞質(zhì)區(qū)的磷酸化tyr位點(diǎn),阻礙STAT與受體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,從而阻止STAT的活化；2)SOCS3可以抑制JAK激酶活性，阻斷JAK/STAT通路[14]。多個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，SOCS3可通過(guò)其結(jié)構(gòu)中的SH2部分，競(jìng)爭(zhēng)性的與JAK2中JH1的酪氨酸殘基直接結(jié)合，實(shí)現(xiàn)其抑制JAK激酶活性的作用。也有反向?qū)嶒?yàn)證實(shí)，如果去除N端靠近SH2結(jié)構(gòu)域的12個(gè)氨基酸結(jié)構(gòu)，SOCS3則失去此作用，因此間接證明SOCS3是通過(guò)SH2結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)其抑制JAK激酶，阻斷STAT磷酸化的作用的；3)通過(guò)C2末端同源區(qū)即SOCS盒與延伸蛋白復(fù)合體相互作用。延伸蛋白是一種泛酸酶的組成部分,將SOCS3結(jié)合的信號(hào)因子(如JAK和STAT等)通過(guò)泛酸化途徑降解,從而阻斷細(xì)胞因子的信號(hào)傳遞，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長(zhǎng)與分化。從而促進(jìn)了興奮性神經(jīng)元凋亡中的作用。STAT3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中亦廣泛分布[15]。

本實(shí)驗(yàn)中，丹參酮ⅡA觀察組與對(duì)照組比較，SOCS3mRNA表達(dá)明顯增高，STAT3mRNA表達(dá)明顯下降，提示丹參酮ⅡA可通過(guò)SOCS3/STAT3信號(hào)通路，抑制炎性反應(yīng)，改善急性損傷脊髓組織的原發(fā)損害，改善病灶缺血、水腫，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能恢復(fù)，減輕脊髓繼發(fā)性損傷而起到急性脊髓損傷的保護(hù)作用。