當歸四逆湯對大鼠糖尿病周圍神經病變的防治作用及對乙二醛酶Ⅰ的影響

周曉晶 李 晶 于江波 王永彬 李 欣 邢日新 明容美 張文風

(長春中醫藥大學，吉林 長春 130017)

糖尿病周圍神經病變(DPN)是最常見的糖尿病并發癥，患病率為30%～90%〔1〕。它是一種復雜的進行性神經功能障礙，表現為遠端周圍神經對稱性退化，出現間歇性持久的肢體疼痛和喪失感覺等癥狀。隨著病情的發展，出現糖尿病潰瘍和非創傷性截肢〔2〕，據統計臨床50%～70%的非創傷性截肢均由其引起，嚴重影響人們的生活質量。糖基化終末產物(AGEs)即高血糖時產生的非正常糖代謝產物，現已明確其可積聚于周圍神經組織，與其受體結合啟動下游信號通路干擾正常神經元的功能，從而造成神經損傷〔3〕。文獻報道乙二醛酶Ⅰ(GLO1)為AGEs生成的上游開關，可將多余的糖轉化為乙二醛(MD)，從而減少AGEs生成〔4〕。臨床研究已發現當歸四逆湯能有效改善DPN患者主觀神經癥狀，改善膝、跟腱反射及神經傳導速度〔5〕。本研究以GLO1為靶點，研究當歸四逆湯能否通過調節GLO1含量及活性來防治DPN，進一步明確DPN的發病機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與模型建立 雄性Wistar大鼠40只，體重(240±20)g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，動物合格證號：SCXK(吉)2016-0003。大鼠隨機分籠飼養于無特殊病原菌(SPF)條件下。喂養1 w、禁食12 h，于左下腹腔內注射鏈脲佐菌素(STZ，50 mg/kg)，72 h后尾靜脈取血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L的大鼠為模型鼠。

1.2分組及給藥 造模3 d后將模型鼠隨機分為3組，每組10只，即模型組、中藥組、西藥組。另取10只正常大鼠設為正常組。模型組、正常組大鼠給予生理鹽水灌胃；中藥組大鼠給予熬制的當歸四逆湯7.44 g·kg-1·d-1灌胃，西藥組以100 mg·kg-1·d-1氨基雙胍灌胃，干預8 w。每天稱量體重及監測血糖。

1.3取材及檢測指標

1.3.1檢測坐骨神經傳導速度 給藥8 w后，各組大鼠腹腔注射20%烏拉坦(5 ml/kg)麻醉，俯臥固定分離坐骨神經。檢測坐骨神經傳導速度：利用Medlab生物信號采集處理系統來測定坐骨神經運動傳導速度(MCV)和感覺傳導速度(SCV)。刺激點位于坐骨結下，記錄電極位于離刺激點2 cm處，刺激量從較小開始，逐漸增強到超強刺激。神經傳導速度以復合動作電位出現的潛伏期與傳導的距離比值來表示。

1.3.2檢測坐骨神經形態變化 給藥8 w后，分離大鼠雙側坐骨神經，檢測坐骨神經形態變化。病理形態檢測：坐骨神經放入10%甲醛溶液中固定，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟、石蠟包埋，連續切片，厚度為4 μm，HE染色，進行光鏡下病理形態學檢測。

1.3.3分光光度法檢測坐骨神經GLO1活性 將坐骨神經超聲勻漿，勻漿液4℃放置40 min，低溫離心10 000 r/min離心15 min，取上清，用Lorry法測上清中蛋白濃度，繼而測GLO1活性。

1.3.4熒光定量PCR法檢測GLO1 mRNA的表達 提取總RNA，逆轉錄生成cDNA，利用引物擴增GLO1，以GADPH做內參，引物序列：GAPDH上游引物5′-CCATgTACgTAgCCATCC-3′,下游引物5′-AACCgCTCATTgCCgATAg-3′;GLO1上游引物5′-ATCTTgAACgAACgCCAgAC-3′,下游引物5′-gggATTgCTCCTgATgT-3′。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物。利用2-△△CT值來比較各目的基因的mRNA表達情況。

1.3.5Western印跡法檢測GLO1蛋白的表達 于4℃下，利用細胞裂解液勻漿坐骨神經，提取總蛋白。用Lorry法對蛋白進行定量。每孔加入20 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后將凝膠上的蛋白轉移到硝酸纖維膜上，加封閉液于室溫下封閉2 h，加入兔抗鼠抗體(美國Sigma公司)和GAPDH多克隆抗體，37℃孵育2 h，洗膜后加入辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，37℃孵育2 h，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。

1.4統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1當歸四逆湯對DPN大鼠體重和血糖的影響 與正常組相比，各組大鼠體重明顯減輕(P<0.01)，血糖均明顯升高(P<0.01)；與模型組及西藥組相比，中藥組大鼠體重明顯增加、血糖明顯降低(P<0.05)。表明當歸四逆湯明顯改善糖尿病大鼠的體重和血糖，見表1。

表1 各組大鼠體重及血糖變化

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組及西藥組比較：2)P<0.05

2.2當歸四逆湯對DPN大鼠坐骨神經病理形態的影響 正常組坐骨神經縱切表現為有髓神經纖維排列緊密，髓鞘組織正常，施萬細胞散在髓鞘邊緣；橫切髓鞘內軸突清晰可見。模型組坐骨神經縱切表現為神經纖維腫脹，鞘細胞減少；橫切表現為神經外膜毛細血管擴張充血，炎細胞浸潤，部分軸突消失。西藥組坐骨神經出現部分神經纖維腫脹，鞘細胞數目減少，大部分髓鞘溶解。中藥組坐骨神經表現為神經中可見到少數正常髓鞘，鞘細胞數目增多，髓鞘中可見正常軸突。說明當歸四逆湯對糖尿病大鼠坐骨神經形態具有明顯保護作用，見圖1。

2.3當歸四逆湯對DPN大鼠坐骨神經傳導速度的影響 與模型組相比，各組坐骨神經MCV和SCV都明顯升高(P<0.01)，說明當歸四逆湯和彌可保都能提高糖尿病大鼠神經傳導速度。但西藥組神經傳導速度與正常組差異有統計學意義(P<0.05)，而中藥組與正常組差異無統計學意義(P>0.05)，說明雖然當歸四逆湯與彌可保都能提高神經傳導速度，但是當歸四逆湯的效果更好，神經傳導速度接近于正常水平，見表2。

圖1 各組坐骨神經病理形態觀察(HE，×40)

表2 各組坐骨神經傳導速度變化

與模型組比較：1)P<0.01；與正常組比較：2)P<0.05，下表同

2.4當歸四逆湯對DPN大鼠坐骨神經中GLO1活性、蛋白表達及mRNA水平的影響 與正常組相比，模型組坐骨神經中的GLO1酶活性、蛋白表達及mRNA水平明顯降低(P<0.05)，而中藥組均顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，中藥組坐骨神經中的GLO1酶活性、蛋白表達及mRNA水平增加更為明顯(P<0.01)，說明當歸四逆湯能夠增強GLO1活性，上調其蛋白和mRNA表達，見圖2，表3。

圖2 各組坐骨神經內GLO1蛋白及mRNA水平

表3 各組大鼠坐骨神經內GLO1的變化

3 討 論

現已公認高糖時造成AGEs積聚，AGEs與其受體RAGE結合啟動的下游信號通路在DPN發病中起著關鍵作用。如果能降低AGEs水平，將會切斷后續的信號通路，從而可以阻止周圍神經病變。那么如何降低AGEs水平呢？我們還需追溯AGEs產生的原因及過程。如前所述AGEs是高血糖狀態下產生的非正常糖代謝產物，產生主要有兩條途徑，其中重要的產生途徑為通過高糖產生的活性二羰基如3-脫氧葡萄糖、乙二醛、甲基乙二醛或α-羰基醛與蛋白質、脂質和核酸結合而成的〔6〕。要控制AGEs的生成需切斷此途徑，減少活性二羰基或α-羰基醛生成AGEs的機會?；诖宋覀兛梢园涯抗饧杏谝叶┟赶到y，該酶系統包括GLO1和GLO2，可將有糖化活性的活性二羰基和α-羰基醛催化生成相應的無糖化活性的酸，減少AGEs的生成〔7，8〕。其中GLO1是α-羰基醛代謝系統的限速酶，能防止活性二羰基在細胞內的堆積進而產生AGEs，被認為是防止AGEs形成的關鍵酶〔4〕，因此提高GLO1含量及活性可減少AGEs的生成切斷AGEs/RAGE信號通路，從而降低由此信號通路導致的DPN。本研究發現當歸四逆湯對DPN大鼠的抑制作用或許是通過增強GLO1活性及表達實現的。